組蛋白去乙酰化酶6在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及意義

林曉驥，錢紫君，倪勵斌，孫妮，周曉海，童歡歡，周舒萍，姚榮欣

（溫州醫科大學附屬第二醫院 血液科，浙江 溫州 325027）

組蛋白去乙酰化酶6在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及意義

林曉驥，錢紫君，倪勵斌，孫妮，周曉海，童歡歡，周舒萍，姚榮欣

（溫州醫科大學附屬第二醫院 血液科，浙江 溫州 325027）

目的：觀察組蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）在彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）中的表達情況，并探討其與各種臨床病理因素及生存情況的關系。方法：選取2007年12月-2015年9月在溫州醫科大學附屬第二醫院確診的93例DLBCL患者和15例反應性淋巴結增生患者作為研究對象。應用免疫組織化學染色檢測DLBCL組織HDAC6蛋白表達情況，χ2檢驗和Kaplan-Meier法分析HDAC6的表達與各種臨床因素和生存情況的關系。結果：在93例DLBCL組織中HDAC6高表達率為69.9%，顯著高于反應性淋巴結增生組織的20%（P＜0.05）。在DLBCL中，高表達組國際預后指數（IPI）評分為0～2分的比例顯著高于低表達組（P＜0.05），乳酸脫氫酶升高和β2-微球蛋白值升高比例均顯著低于低表達組（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析結果顯示HDAC6高表達組的5年總生存時間和無進展生存時間均顯著高于低表達組。結論：HDAC6在DLBCL患者中呈高表達，高表達組患者有IPI評分低和腫瘤負荷輕的特點。HDAC6高表達是DLBCL的良好預后因素。

彌漫性大B細胞淋巴瘤；組蛋白去乙酰化酶6；預后

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是惡性淋巴瘤WHO分類中最常見的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）類型，占成人NHL的30%～40%，為一組異質性很強的B細胞性淋巴瘤[1]。DLBCL臨床病程呈侵襲性，隨著免疫化療的引入，本病的長期緩解率得到了進一步提高，但仍有部分DLBCL患者療效不佳。因此，國內外學者熱衷于對DLBCL發病機制和預后相關因

素進行研究[2-3]。組蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）作為HDAC家族中的一員，被證實與多種不同的腫瘤發生發展關系密切。MARQUARD等[4]研究揭示，在皮膚T細胞淋巴瘤中發現有HDAC6的異常表達，而且HDAC6的表達程度與患者的預后呈正相關，HDAC6高表達的患者生存時間更長。但有關HDAC6在DLBCL中的作用研究甚少，因此我們探討HDAC6在DLBCL中的表達及臨床意義，為DLBCL的預后提供可靠的預測指標。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2007年12月至2015年9月在溫州醫科大學附屬第二醫院確診，資料完整的93例DLBCL患者為研究對象，另選15例淋巴結反應性增生患者作為對照。所有病例的組織病理學診斷嚴格按照WHO造血和淋巴組織腫瘤性疾病分類標準[5]。臨床分期和近期療效分別參照Ann Arbor標準[6]和1999年淋巴瘤療效評價標準[7]進行評價。本研究經溫州醫科大學附屬第二醫院倫理委員會通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色：所有石蠟標本制成3～5 μm厚度的切片，進行免疫組織化學染色（SP法）。嚴格按照試劑盒說明書，將已確定的陽性組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。用HDAC6鼠抗人單克隆抗體（美國Abcam公司）檢測HDAC6的表達，胞質出現棕黃色顆粒判為陽性。

1.2.2 免疫組織化學染色程度評分及實驗分組：不著色為0分，著色淡為1分，著色適中為2分，著色深為3分；陽性細胞百分比評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。按兩積分相乘計算總分，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～6分為中等陽性（++），＞6分為強陽性（+++）。參考相關文獻[8]，將HDAC6表達（-/+）劃為低表達組，（++～+++）劃為高表達組。

1.2.3 治療方法：所有DLBCL患者均接受R-CHOP或CHOP方案化療。CHOP方案：環磷酰胺750 mg/m2，靜脈注射，第1天；表阿霉素70～90 mg/m2，靜脈注射，第1天；長春地辛2 mg/m2，靜脈注射，第1天；潑尼松100 mg/m2，口服1～5 d。R-CHOP方案：在CHOP方案基礎上，在化療前1 d給予利妥昔單抗375 mg/m2，靜脈滴注。3周為1療程，中位化療療程為5（4～8）個。對化療后殘留病灶或化療前巨大腫塊給予區域放療（范圍8～50 Gy，中位45 Gy）。

1.2.4 隨訪：隨訪的截止時間為死亡或2015年12 月11日，中位隨訪時間47（4～98）個月。本組的研究終點是總生存時間（overall survival，OS）和無進展生存時間（progression-free survival，PFS）。OS定義為初次確診至死亡或末次隨訪時間，PFS定義為治療有效開始至淋巴瘤進展、復發、死亡或末次隨訪時間。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS13.0統計軟件進行處理。計數資料采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 DLBCL組織中HDAC6的表達情況（×400）

2.1 DLBCL患者HDAC6表達情況 HDAC6呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞的胞質。93例DLBCL患者中，低表達組28例（占30.1%），其中弱陽性12例，陰性16例；高表達組65例（占69.9%），其中中等陽性24例，強陽性41例，見圖1。15例反應性淋巴結增生患者中，高表達組3例（占20%），低表達組13例（80%），與DLBCL患者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 DLBCL患者HDAC6表達情況與臨床特征關系HDAC6高表達組的國際預后指數（international prognostic index，IPI）為3～5的患者比例顯著低于低表達組（P＜0.05）；高表達組的乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）升高患者比例顯著低于低表達組（P＜0.05），β2-微球蛋白升高患者比例亦低于低表達組（P＜0.05）；低表達組與高表達組的性別、年齡、Ann Arbor分期、ECOG評分、GCB/ 非GCB比例以及原發部位差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 HDAC6表達與DLBCL臨床特征的關系[例（%）]

2.3 HDAC6對DLBCL患者生存的影響 93例患者5年OS和5年PFS分別為59.5%和46.1%；HDAC6低表達組的5年OS（為41.9%）顯著低于高表達組（為69.0%）（χ2=5.54，P=0.011）；低、高表達組的5年PFS分別為32.2%和53.4%，差異有統計學意義（χ2=4.30，P= 0.038），見圖2。依據治療方案分層分析顯示，接受CHOP方案和R-CHOP方案的患者5年OS分別是52.8% 和67.3%（χ2=5.31，P=0.018）。HDAC6表達在治療方案分層方面仍然與DLBCL患者的總生存率顯著相關（P＜0.05），接受CHOP方案患者中HDAC6低、高表達組5年OS分別為38.9%和62.5%，而接受R-CHOP方案患者中HDAC6低、高表達組5年OS分別為40%和76%，見圖3。

圖2 HDAC6的表達對DLBCL患者預后的影響

3 討論

IPI是DLBCL患者最經典的預后評價體系，但IPI未能涉及腫瘤的分子生物學指標，即使具有相同IPI評分的患者預后仍有可能存在較大差異。因此國內外學者紛紛致力于尋找與DLBCL預后相關的標志物。由于DLBCL細胞表面的抗原獲取相對容易，其作用也成為研究的熱點。

圖3 HDAC6的表達對接受不同治療方案DLBCL患者預后的影響

HDAC是DNA復制、轉錄、修復過程中的調控關鍵酶之一。HDAC6為HDAC家族中的一員，其基因位于Xp11.23染色體上，主要在腎臟、心臟及肝臟等組織表達。目前，HDAC6由于與腫瘤關系密切而備受廣大科研工作者青睞。LEE等[9]研究顯示在SKOV3轉化的卵巢癌細胞系、MCF-7乳腺癌細胞系和SKBR3乳腺癌細胞系中，HDAC6基因的敲除能不同程度地抑制細胞增殖；動物實驗也進一步證實HDAC6特異性的shRNA處理后的SCID小鼠的腫瘤生長明顯受抑制，如進一步用野生型的HDAC6重構HDAC6敲除的小鼠，能重新獲得最初的表型。由此可見，HDAC6在腫瘤的生長過程中扮演著極其重要的角色，可能會成為治療腫瘤的重要分子靶點。

目前研究結果顯示，HDAC6在口腔鱗癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌以及多發性骨髓瘤等均呈高表達，且HDAC6的表達與腫瘤的大小、惡性程度和轉移密切相關[10-13]。然而有關HDAC6在DLBCL中的表達情況以及與臨床病理特征和預后的相關性報道甚少。MARQUARD等[14]研究表明HDAC6在31例DLBCL患者中存在異常表達，HDAC6表達率高達71%，而且HDAC6低表達患者可能預后不良。本研究結果顯示在DLBCL患者中有69.9%呈高表達HDAC6，與文獻報道基本一致，而高表達HDAC6的DLBCL患者IPI評分為3～5、LDH升高和β2-微球蛋白值升高比例均顯著低于低表達患者，因此本研究提示DLBCL患者存在HDAC6的異常表達，而高表達組患者有IPI評分低和腫瘤負荷輕的特點。本研究通過生存分析發現HDAC6高表達組的5年0S和PFS均顯著高于低表達組。眾所周知，R-CHOP方案治療DLBCL的療效和預后遠遠高于接受CHOP方案治療的患者，而本研究同樣顯示接受R-CHOP方案治療的DLBCL患者的預后較好。為了排除治療方案對預后的干擾，我們對治療方案進行分層分析，結果顯示，在不同治療方案的情況下，HDAC6高表達組總生存率均顯著高于低表達組。以上結果高度提示HDAC6的表達可能是DLBCL患者的獨立的良好預后因素。

綜上所述，HDAC6在DLBCL患者中呈高表達，而HDAC6的高表達是DLBCL患者的良好預后因素。因而我們可以通過對HDAC6的表達分析為DLBCL患者提供更準確的預后判斷。

[1] ARMITAGE J O, WEISENBURGER D D. New approach to classifying non-Hodgkin’s lymphomas： clinical features of the major histologic subtypes. Non-Hodgkin’s Lymphoma Classification Project[J]. J Clin Oncol, 1998, 16(8)： 2780-2795.

[2] GASCOYNE R D. Emerging prognostic factors in diffuse large B cell lymphoma[J]. Curr Opin Oncol, 2004, 16(5)：436-441.

[3] 趙靜, 黃小芳, 楊開顏, 等. ZAP-70在B細胞非霍奇金淋巴瘤中的表達及其意義[J]. 溫州醫學院學報, 2009, 39(6): 616-618.

[4] MARQUARD L, GJERDRUM L M, CHRISTENSEN I J, et al. Prognostic signifi cance of the therapeutic targets histone deacetylase 1, 2, 6 and acetylated histone H4 in cutaneous T-cell lymphoma[J]. Histopathology, 2008, 53(3)： 267-277.

[5] SABATTINI E, BACCI F, SAGRAMOSO C, et a1. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues in 2008： an overview[J]. Pathologica, 2010, 102(3)：83-87.

[6] ROSENBERG S A. Validity of the Ann Arbor staging classifi cation for the non-Hodgkin’s lymphomas[J]. Cancer Treat Rep, 1977, 61(6)： 1023-1027.

[7] CHESON B D, HORNING S J, COIFFIER B, et al. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin’s lymphomas[J]. J Clin Oncol, 1999, 17(4)：1244.

[8] ZHANG Z, YAMASHITA H, TOYAMA T, et al. HDAC6 expression is correlated with better survival in breast cancer [J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(20)： 6962-6968.

[9] LEE Y S, LIM K H, GUO X, et al. The cytoplasmic deacetylase HDAC6 is required for effi cient oncogenic tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2008, 68(18)： 7561-7569.

[10] AZUMA K, URANO T, HORIE-INOUE K, et al. Association of estrogen receptor alpha and histone deacetylase 6 causes rapid deacetylation of tubulin in breast cancer cells [J]. Cancer Res, 2009, 69(7)： 2935-2940.

[11] KAKIHANA M, OHIRA T, CHAN D, et al. Induction of E-cadherin in lung cancer and interaction with growth suppression by histone deacetylase inhibition[J]. J Thorac Oncol, 2009, 4(12)： 1455-1465.

[12] HIDESHIMA T, BRADNER J E, WONG J, et al. Smallmolecule inhibition of proteasome and aggresome function induces synergistic antitumor activity in multiple myeloma [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(24)： 8567-8572.

[13] SAKUMA T, UZAWA K, ONDA T, et al. Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2006, 29(1)： 117-124.

[14] MARQUARD L, POULSEN C B, GJERDRUM L M, et al. Histone deacetylase 1, 2, 6 and acetylated histone H4 in B-and T-cell lymphomas[J]. Histopathology, 2009, 54(6)： 688-698.

（本文編輯：吳彬）

Expression of histone deacetylase 6 in diffuse large B-cell lymphoma and its clinical significance

LIN Xiaoji, QIAN Zijun, NI Libin, SUN Ni, ZHOU Xiaohai, TONG Huanhuan, ZHOU Shuping, YAO Rongxin. Department of Hematology, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To explore the histone deacetylase 6 (HDAC6) expression in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and to analyze its relationship with the clinicopathological characteristics and survival.Methods:The clinical data from 93 DLBCL patients and 15 patients with reactive hyperplasia of lymph node who were treated in the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University from December 2007 to September 2015 was retrospectively analyzed. Cases were subjected to immunohistochemical staining for HDAC6 protein expression in the DLBCL tissue. SPSS was used to analyze the relationship between HDAC6 expression and various clinical factors, and the relationship between HDAC6 and survival.Results:High expression rates of HDAC6 protein in 93 DLBCL tissues were 69.9%, which was signifi cantly higher than 20% in reactive hyperplasia of lymph node (P＜0.05). In DLBLC, the ratio of IPI (0-2) in high expression group was signifi cantly higher than that in low expression group but the ratio of increased LDH and β2-microglobulin in high expression group was signifi cantly lower than that in low expression group (P＜0.05). On Kaplan-Meier analysis, the 5-year overall survival and the 5-year progression free survival in high expression group was signifi cantly higher than that in the low expression one.Conclusion:HDAC6 is highly expressed in DLBCL patients, patients with highly expressed HDAC6 represents low IPI score and light tumor burden. The highly expressed HDAC6 as a favorable prognostic factor has more prognostic value for DLBCL.

diffuse large B-cell lymphoma; histone deacetylase 6; prognosis

R557

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.007

2016-07-01

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20130205）。

林曉驥（1983-），男，浙江溫州人，主治醫師。

姚榮欣，主任醫師，碩士生導師，Email：yaorx0821@ 163.com。