亮氨酸氨肽酶-3(LAP3)在非小細胞肺癌中的表達

賈亮亮 崔學范

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及臨床意義

亮氨酸氨肽酶-3(LAP3)在非小細胞肺癌中的表達

賈亮亮1崔學范2

亮氨酸氨肽酶-3； 非小細胞肺癌； 免疫組織化學； 總生存期

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，在發達國家中，肺癌導致的死亡率居于所有惡性腫瘤的首位[1-2]。非小細胞肺癌占所有肺癌患者80%以上，雖然經過數十年的探索和研究，肺癌的預后，尤其是非小細胞肺癌的預后，依然不容樂觀[3]，患者的5年存活率依然很低，不超過15%[4]。造成這種預后不良的主要原因是由于確診的時候大多處于腫瘤的晚期。因此，如果有新的生物標志物可以發現早期肺癌，將有助于肺癌的早期診斷和治療。

亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidases, LAPs)，是一類含鋅的金屬酶，可以催化氨基酸N末端的多肽的裂解，從而促進肽鍵的水解[5]；其功能是參與細胞內蛋白質降解的終末環節，通過泛素-蛋白酶體途徑將蛋白質裂解為小分子肽參與抗原呈遞，或全水解為游離氨基酸用于新的蛋白質的合成[6]。此外，LAPs是諸如蛋白質成熟、肽的降解和細胞周期控制等生理重要過程中必不可少的[7]。Rutenburg等[8]研究表明胰腺癌患者血清和尿液中LAP活性顯著升高，惡性淋巴瘤和白血病患者尿液中LAP活性升高；Willighagen和Planteydt[9]發現在外科手術切除的人類腫瘤組織中LAPs表達增高在腫瘤細胞核基質中；研究表明，在食管鱗狀細胞癌和肝細胞癌中LAP3促進腫瘤的生長[10]。但是，非小細胞肺癌和LAP3的關系尚不清楚。

本實驗采用免疫組化研究LAP3在手術切除的非小細胞肺癌患者癌組織和癌旁正常組織中的表達，探討LAP3表達與生存率及臨床病理參數如吸煙、性別、年齡、TNM分期及分化程度等之間的關系。

對象與方法

一、研究對象

收集南通大學附屬醫院2005年8月至2008年7月間收治的經過臨床病理確診、臨床隨訪資料完整的NSCLC患者137例。隨訪1～70個月，其中男性66例，女性71例；患者年齡35～82歲，中位年齡60歲；臨床分期按2009版非小細胞肺癌TNM標準分期：Ⅰ期92例，Ⅱ期30例，Ⅲ期15例；分化程度分級：低分化17例，中分化92例，高分化28例；有淋巴結轉移者52例，無淋巴結轉移者85例。所有病例均未行術前化療、放療，并從腫瘤遠端(至少5 cm處)取相應癌旁組織并經病理證實為正常肺組織作為對照。標本取材后一部分貯存于-80 ℃冰箱中備用；一部分放置于4%的福爾馬林溶液中固定，做成石蠟切片備用。

二、研究方法

1. 組織中蛋白的提取及Western blot反應：取出NSCLC組織及其配對癌旁正常組織，勻漿，重懸于8倍體積的RIPA裂解液中，置于冰上裂解30 min。4 ℃，以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心20 min后取上清，測定蛋白濃度。聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，分離之后采用電泳法轉移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入LAP3抗體(1︰500，Santa Cruz Biotechnology)和抗GAPDH抗體(1︰1 000)，4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1︰3 000)室溫孵育2 h，常規洗膜，ECL顯色，結果經自動電泳凝膠成像分析儀采集，進行灰度值測定。

2. 免疫組化及結果判定：將石蠟組織連續制成4 μm厚度的切片，并在65 ℃烤30 min備用。采用免疫組化染色二步法，石蠟切片脫蠟、水化后，高溫抗原修復，過氧化氫滅活內源性過氧化物酶活性，山羊血清工作液封閉。抗LAP3的抗體(1︰50，Abgent)和抗Ki-67的抗體(1︰50，Santa Cruz Biotechnology)在4 ℃冰箱中孵育過夜，IgG為陰性對照。滴加二抗，DAB染色，蘇木精復染。LAP3免疫組化陽性信號定位于胞漿，Ki-67陽性信號定位于胞核。每個切片隨機選5個高倍鏡視野，每個視野至少500個細胞，根據細胞著色范圍和著色強度進行評分。著色范圍評分如下：0分(陽性腫瘤細胞<10%)、1分(陽性腫瘤細胞在10%～30%之間)、2分(陽性腫瘤細胞在30%～50%之間)、3分(陽性腫瘤細胞在50%～70%之間)、4分(陽性腫瘤細胞>70%)。著色強度評分如下：0分(無著色)、1分(淡染)、2分(黃色顆粒)、3分(棕褐色顆粒)。根據著色范圍和著色強度的成績將LAP3分為低表達組(0～4分)和高表達組(5～12分)

三、統計學方法

采用SPSS 13.0統計分析軟件，對LAP3表達和臨床病理因素的關系用卡方檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、LAP3蛋白在NSCLC組織及配對癌旁正常組織中的表達

采用Western blot技術檢測NSCLC及其配對癌旁正常組織中LAP3蛋白的表達量。結果顯示NSCLC組織中LAP3蛋白的表達量(0.89±0.04)明顯高于癌旁正常組織(0.13±0.01)(P<0.05，圖1)，提示LAP3在NSCLC發生發展中有重要作用。

圖1 LAP3蛋白在NSCLC組織及配對的癌旁正常組織的表達

二、NSCLC中LAP3蛋白表達與臨床病理特征的關系

采用免疫組化SP法檢測LAP3蛋白在137例NSCLC組織及其癌旁正常組織中的表達。LAP3在正常肺泡上皮組織中未著色，在腫瘤組織中陽性信號定位于胞質中，見圖2。對臨床病理因素進行分析發現LAP3蛋白的表達與年齡、性別、腫瘤大小、吸煙等無相關，見表1。但有淋巴結轉移的肺癌組織中LAP3陽性率明顯高于無淋巴結轉移者(P=0.001)，Ⅰ+Ⅱ期患者LAP3的陽性明顯低于Ⅲ期患者(P=0.001)，高分化的NSCLC患者中LAP3的陽性率低于低分化+中分化患者(P=0.005)。

圖2 正常肺泡上皮組織；注:(A)和NSCLC組織(B)中LAP3蛋白的表達 IHC(×400)

三、LAP3表達的生存分析

137例隨訪結果顯示，LAP3高表達的患者比低表達的患者有更長的總生存期，其差異有統計學意義(P<0.001，圖3)。結果表明，LAP3是NSCLC患者總生存期的獨立預后因子。

圖3 NSCLC患者中LAP3蛋白高表達和低表達的生存曲線比較

表1 LAP3表達與NSCLC患者臨床病理特征之間的關系

討 論

癌癥的發生和發展是多基因共同作用的結果，與癌基因的激活和抑癌基因的失活等遺傳因素有關，同時受多種環境因素的影響[11]。DNA損傷修復機制的異常和細胞周期調控紊亂是惡性腫瘤發生發展的重要機制[12]。LAPs是諸如蛋白質成熟、多肽的降解及細胞周期調控等重要生理過程中必不可少的，癌細胞的生長和增殖依賴于LAPs所分解產生的游離氨基酸。先前的研究表明LAPs的異常表達與人類的許多癌癥相關，例如子宮內膜癌、卵巢上皮惡性腫瘤等[13]。本研究中LAP3與NSCLC組織的分化程度、淋巴結轉移、TNM分期密切相關。Kaplan-Meier生存分析結果表明，LAP3高表達組比低表達組總生存時間明顯下降，表明LAP3高表達與NSCLC患者的不良預后有關，是影響患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，LAP3表達在NSCLC組織和癌旁正常組織中存在差異，LAP3可能與NSCLC的發生、發展有關。LAP3蛋白表達在NSCLC中的臨床病理和預后的意義表明，LAP3低表達組比高表達組有更長的生存期，并且LAP3表達是影響NSCLC預后的獨立因素。LAP3蛋白在NSCLC中的發生發展過程中具有重要的作用，為非小細胞肺癌的研究提供了新的思路和方向。

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(本文編輯：黃紅稷)

賈亮亮，崔學范. 亮氨酸氨肽酶-3(LAP3)在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(3)： 329-331.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.020

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2016-03-14)