特發性肺纖維化患者誘導痰中SDF-1的表達與高分辨CT表現的相關性研究

吳東 袁亞連 陳敏 李文 呂權超 黎東明

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特發性肺纖維化患者誘導痰中SDF-1的表達與高分辨CT表現的相關性研究

吳東 袁亞連 陳敏 李文 呂權超 黎東明

目的探討特發性肺纖維化(IPF)患者血清和誘導痰中基質細胞衍生因子-1(SDF-1)的表達水平與肺功能及胸部高分辨CT表現的相關性。方法選取IPF患者32例及健康體檢者30例，收集血清和誘導痰標本并檢測SDF-1表達水平，IPF患者行肺功能和胸部高分辨CT檢查，并對結果作相關分析。結果IPF患者的誘導痰中SDF-1的表達水平為(705.21±11.71)ng/ml，高于健康體檢組的(252.82±10.62)ng/ml，P<0.05差異有統計學意義。血清中SDF-1的表達水平(5.29±0.13)ng/ml高于健康體檢組的(4.93±0.14)ng/ml，但P>0.05，沒有統計學意義。IPF患者肺功能均有限制性通氣功能障礙和彌散功能障礙；影像學表現為程度不一的磨玻璃影、網格影和蜂窩肺，HRCT評分與誘導痰中的SDF-1表達水平呈正相關(r=0.287，P<0.05)。結論SDF-1在IPF患者誘導痰中表達明顯升高，并與患者病情嚴重程度(胸部高分辨CT表現)呈正相關，對IPF診斷和治療具有潛在的參考價值。

特發性肺纖維化； 基質細胞衍生因子-1； 肺功能； 高分辨CT

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種原因不明的，主要累及肺泡的慢性肺部間質性疾病。成纖維細胞在肺部病灶聚集、增殖、激活并分泌大量細胞外基質和纖維蛋白是這類疾病的共同病理過程。IPF的防治主要在于早期診斷和治療，高分辨CT(high-resolution computed tomography, HRCT)是診斷肺纖維化的最重要方法之一；同時HRCT評分被用來評估疾病的嚴重程度，對患者的預后判斷和治療效果監測有重要意義[1-2]。肺功能檢查也是評估肺纖維化病情的一個常用項目，其各項呼吸生理指標可以敏感地反映出纖維化病變對呼吸功能的影響[3]。

目前關于IPF的發病機制尚未完全闡明，李文等[4]研究表明：基質細胞衍生因子- 1(stromal cell- derived factor- 1, SDF- 1)及其特異性受體CXCR4組成的SDF-1/CXCR4軸在循環的成纖維細胞聚集在肺部病灶，促使肺纖維化的發病中起重要作用。目前尚未見有關SDF-1在IPF患者誘導痰中表達情況的報道。本研究通過測定IPF患者血清和誘導痰中的SDF-1水平，并與肺功能及胸部高分辨CT表現作相關性分析，進一步探討SDF-1的表達與IPF臨床特征之間的相關性。

對象與方法

一、研究對象

選取2014年11月至2016年6月在廣東醫科大學第一附屬醫院、第二附屬醫院和湛江市第四人民醫院門診及住院的IPF患者32例，其中男性21例，女性11例，年齡35～81歲，平均58.2歲。所有患者的HRCT檢查和肺功能檢查都在同一周內完成。診斷標準參照美國胸科協會和歐洲呼吸病協會在2011年3月發布的指南[5]：進行性呼吸困難，刺激性干咳，HRCT上有典型特發性肺纖維化的表現：胸膜下和基底部有磨玻璃影、網格影、蜂窩肺和小葉間隔增厚等；肺功能異常，表現為限制性通氣功能障礙和/或彌散功能障礙。肺纖維化組排除標準：①自身免疫性疾病或藥物等已知病因引起的肺部纖維化；②合并肺結核或肺癌等其它肺部疾病者；③惡性腫瘤；④嚴重心腦血管疾病等疾病。健康體檢組選取湛江市第四人民醫院職工體檢人員32例，其中男性20例，女性12例，年齡33～75歲，平均56歲。健康體檢組排除標準[6]：①肺部疾病者；②心腦血管病者；③有精神異常病史者；④重度貧血或肝腎功能異常者；⑤大量酗酒者。兩組間性別、年齡、吸煙率、體重指數、外周血白細胞數和單個核細胞數比較差異無顯著性(P>0.05)，具有可比性。研究征得患者及家屬同意，并經院醫學倫理委員會批準。

二、研究方法

1. 血清標本采集和SDF-1水平測定：抽取IPF組患者和健康體檢組靜脈血5 ml，以離心半徑8 cm，1 400 r/min 離心5 min，取上清，置于凍存管中，-80 ℃保存，待測。采用ELISA法檢測血清SDF-1α水平，試劑盒購自美國R&D公司，檢測步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行。顯色后上酶標儀 (Synergy H1 全功能酶標儀，美國BioTek公司)450 nm處測量OD值，描點，擬合曲線，計算SDF-1的濃度值。

2. 誘導痰的采集與檢測：誘導痰操作參照歐洲呼吸病學會的指引進行，并根據病人病情作必要的安全準備[7]。在檢查開始前，受試者先漱口清潔口腔，采用霧化器霧化吸入3%～4.5%高滲鹽水5～8 ml，囑受試者深咳，將咳出的痰液收集到培養皿中。將無唾液成分的痰挑出置于EP管中，加入4倍體積的0.1%的二硫蘇糖醇，渦旋振蕩15 s；再加入等量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)于37 ℃水浴中振蕩15 min，以離心半徑8 cm，3 500 r/min離心10 min，取上清液分裝，于-80 ℃冰箱凍存待測。采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)測定誘導痰上清中SDF-1水平。

3. HRCT檢查：采用SIEMENS Sensation 64層螺旋CT掃描；患者仰臥，雙手高舉過頭，于深吸氣末屏氣進行掃描，掃描范圍從肺尖至后肋膈角，層距10 mm，螺距1 mm。參數設定為125 kV，160 mA·s，像素矩陣為512×512，肺窗(窗寬1 400～1 600 HU，窗位500～600 HU)和縱隔窗(窗寬350～500 HU，窗位40～50 HU)，拍攝成CT圖像。考慮部分患者因受背部重力墜積效應影響出現偽磨玻璃影，相同條件下取俯臥位局部加掃。采用2004年9月歐洲8國IFIGENIA研究中的方法[8]并進行修改，將CT層面分上、中、下肺野，分別選取主動脈弓上緣層面、氣管隆突平面、右膈頂層面作為代表層面。選擇代表性的征象：磨玻璃影、網格影、蜂窩樣改變占所在層面的百分比分別評分(0分：無此征象；1分：病變所占層面的百分比<5%；2分：病變所占層面的百分比6%～24%；3分：病變所占層面的百分比25%～49%；4分：病變所占層面的百分比50%～75%；5分：病變所占層面的百分比>75%)。由2名有經驗的胸部放射診斷醫師對此3種改變分別評分，三層面分數相加后取平均值，即為各征像CT值。最后，將三種征象的分值相加即得總的HRCT評分。對各征像CT值和總HRCT評分進行診斷一致性分析(kappa分析)，κ>0.4為二者評分基本一致。

4. 肺功能測定：肺功能測定采用德國Jaeger肺功能診斷儀進行。測定指標包括：反映通氣功能的第1秒鐘用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second, FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity, FVC)、反映彌散功能的一氧化碳彌散量(diffusing capacity of the lung for carbon monoxide, DLCO)?？紤]受試者身高、體重、年齡、性別和所從事工作性質等方面的差異，統計數據采用實際值與預計值的比值進行分析。

三、統計學方法

結 果

一、SDF-1在各組血清和誘導痰中的表達水平

IPF患者的誘導痰中SDF-1的表達水平是(705.21±11.71)ng/ml，高于健康體檢組的(252.82±10.62)ng/ml，P<0.01差異有統計學意義。血清中SDF-1的表達水平為(5.29±0.13)ng/ml高于健康體檢組的(4.93±0.14)ng/ml，但是P=0.068，差異無統計學意義，見圖1。

圖1 SDF-1在兩組血清和誘導痰中的表達水平

二、IPF患者肺功能檢查結果及肺功能參數與SDF-1水平的相關性分析

肺功能檢查結果顯示：32例IPF患者均有不同程度的限制性通氣功能障礙，DLCO參數也是明顯低于健康體檢組，見表1。將FVC%預計值、FEV1%預計值及DLCO%預計值與IPF患者血清和誘導痰中的SDSF-1水平作相關分析，無明顯相關性。

表1 兩組的肺功能參數

三、IPF患者HRCT 檢查結果及其與SDF-1水平的相關性

HRCT檢查結果顯示：32例IPF患者的病變均呈彌漫性分布，多為雙側，以肺野外周和下肺為主；其中典型磨玻璃影19例、網格影21例，彌漫性蜂窩肺13例和牽拉性支氣管擴張18例。這組患者的磨玻璃影、網格影和蜂窩肺病變范圍以及CT評分分別為(5.85+2.75)、(6.78+2.95)、(2.23+1.02)和(13.55+1.26)；將上述指標與血清和誘導痰中SDF-1水平作相關分析后發現：誘導痰SDF-1的含量與HRCT評分呈正相關(r=0.287，P<0.01)，見圖2、3。

圖2 CT評分與誘導痰中SDF-1含量的相關性

圖3 代表性病例：男性，59歲，因“進行性呼吸困難2年，加重10天”入院，經纖維支氣管鏡肺活檢結果符合特發性肺纖維化改變；HRCT結果顯示雙肺彌漫性蜂窩樣改變伴雙下肺牽拉性支氣管擴張；肺功能檢查示中度限制性通氣功能障礙和重度彌散功能障礙

討 論

本研究通過測定IPF患者血清和誘導痰中SDF-1的含量，探討了SDF-1的表達水平與患者影像學改變和肺功能檢查參數之間的關系。研究發現：IPF患者誘導痰中的SDF-1水平高于健康體檢組；而且HRCT評分值改變程度與誘導痰中的SDF-1含量的相關性具有統計學意義(r=0.287，P<0.01)。因此可以考慮將誘導痰檢查(SDF-1含量)作為常規判斷患者病情及治療效果監測的檢查項目。

通過誘導痰檢查，監測其中相關的生物標志物來作為IPF診斷和治療的指標是目前研究的一個熱點[8-9]。SDF-1是CXC 趨化蛋白超家族中的一員，包括SDF-1α 和SDF-1β兩種同分異構體。SDF-1α是一種極強的炎性細胞趨化因子，對淋巴細胞 、中性粒細胞及單核-巨噬細胞等炎性細胞具有強大的趨化作用。在致炎因子的作用下SDF-1α表達增強，形成從病灶到外周血循環的濃度梯度，CXCR4+的炎性細胞沿著這個濃度梯度集聚、黏附、穿過內皮細胞，到達病灶；同時炎性細胞上的SDF-1-CXCR4軸存在正反饋效應，促使炎癥細胞又大量分泌新一輪的SDF-1α，從而進一步加劇病灶局部的炎癥過程[10-11]。 研究表明：CXCR4是 SDF-1 唯一的受體，在成纖維細胞表面呈高度表達，在IPF發病過程中起重要作用[12]。李文等[4]研究發現：SDF-1 通過與 CXCR4 結合，促進成纖維細胞沿 SDF-1 的濃度梯度發生遷移、增殖、歸巢并抑制成纖維細胞的凋亡。在本研究中，IPF患者誘導痰中的SDF-1濃度比血清中的明顯升高，說明從外周血到肺部存在SDF-1的濃度梯度，循環中的成纖維細胞可能沿著這一梯度聚集到肺部病灶并增殖，并分泌大量的纖維蛋白。而IPF患者血清中的SDF-1水平雖然比健康體檢組高，但是沒有達到統計學標準，這可能是由于本組患者已經處于疾病的典型纖維化期，血清中的SDF-1已經有所下降。

IPF的臨床表現主要為進行性的呼吸困難和咳嗽，目前缺乏特異性的藥物，臨床治療僅在疾病的早期起到一定的效果，普遍預后都較差。 目前大多數學者認為早期診斷和干預對IPF患者的預后非常重要[13]。HRCT因具有極好的空間分辨率，可以清晰地反映出肺部的細微結構變化和肺纖維化程度，并且與病理特征有很好的相關性，是目前診斷肺纖維化性疾病最重要的影像學方法，同時HRCT半定量評分也常用于評價患者的治療效果和預后[14]。本研究結果顯示：32例IPF患者的病變均呈彌漫性分布，多為雙側，以肺野外周和下肺為主；其中典型磨玻璃影19例、網格影21例和彌漫性蜂窩肺13例，牽拉性支氣管擴張18例。將這組患者的磨玻璃影、網格影和蜂窩肺病變范圍以及CT評分與血清和誘導痰中SDF-1水平作相關分析后發現：誘導痰SDF-1的含量與HRCT評分呈正相關(r=0.287，P<0.01)。分析其中原因為：肺內SDF-1含量高，受其趨化而來的炎癥細胞和成纖維細胞就多，最后導致肺纖維化程度越重，從影像學上反映出來HRCT評分就越高。肺纖維化發病過程中，氣道壁Ⅲ、Ⅳ型膠原的增加和成纖維細胞的增多引起氣道重建，部分肺泡腔閉塞，肺順應性降低，肺活量降低，導致限制性通氣功能障礙[15]；同時由于肺泡間隔增厚，彌散距離增加，DLCO 和 DLCO/VA 下降，即出現彌散功能障礙[2]。在本組患者中均存在限制性通氣功能障礙和彌散功能障礙；而且IPF患者的誘導痰SDF-1水平與彌散功能(DLCO%預計值)有一定的相關性(r=0.092，P=0.062)，但是未達到統計學意義，這可能與本組病例數較少有關。

本研究也存在一些不足，例如：IPF入組病例有限，而且性別差異比較大，這在一定程度上影響部分結果的統計學意義；但是本研究結果還是可以為以后更大規模的研究提供有用的試驗數據。

綜上所述，SDF-1在IPF中表達明顯升高，并且與臨床病情特征有很好的相關性。誘導痰檢查(SDF-1含量)可作為判斷患者病情及治療效果的監測項目；特別是結合影像學(HRCT)分析更能反映病變程度及治療效果。

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(本文編輯：張大春)

吳東，袁亞連，陳敏，等. 特發性肺纖維化患者誘導痰中SDF-1的表達與高分辨CT表現的相關性研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(3)： 296-299.

Correlation between the high-resolution computed tomography parameters and levels of stromal cell-derived factor 1 in induced sputum of idiopathic pulmonary fibrosis patients

WuDong,YuanYalian,ChenMin,LIWen,LvQuanchao,LiDongming.

InstituteofRespiratoryDiseases,DepartmentofRespiratory,TheAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China

LiDongming,Email: 3064264@qq.com

Objective To evaluate concentrates of stromal cell-derived factor in serum and induced sputum supernatants from idiopathic pulmonary fibrosis(IPF) patients, investigate the relationship between the stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) level and the high-resolution computed tomography parameters in patients and explore the role of SDF-1 in the diagnosis and treatment of IPF. Methods Serum and induced sputum samples were collected from 30 healthy controls and 32 patients with IPF. The concentrations of SDF-1 in serum and induced sputum were measured by ELISA. Lung function and chest high-resolution CT were executed in patients with IPF. Analysis of correlation was performed on these results. Results The concentration of SDF-1 in induced sputum was significantly increased in IPF group(705.21±11.71)ng/ml compared with healthy group(252.82±10.62)ng/ml(P<0.05). The level of SDF-1 in serum was also elevated in IPF patients(5.29±0.13)ng/ml compared with healthy group(4.93±0.14)ng/ml, but there was no statistically significant difference (P>0.05). All patients with IPF have restrictive ventilation dysfunction and diffusion dysfunction. There was a positive relationship between induced sputum SDF-1 level and HRCT score(r=0.287,P<0.01). Conclusions The expression of SDF-1 in induced sputum was significantly increased, and associated positively with severe degree (chest high-resolution CT manifestations) of patients with IPF. SDF-1 may play an important role in the pathogenesis of IPF, therefor serve as a potent testing index of the diagnosis and treatment of IPF.

Idiopathic pulmonary fibrosis; Stromal cell-derived factor-1; Lung function; High-resolution computed tomography

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.011

廣東省高校優秀青年創新人才培育基金項目 (LYM09086)

524001 湛江，廣東醫科大學附屬醫院呼吸疾病 研究所·呼吸內科

黎東明， Email： 3064264@qq.com

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2017-03-20)