人端粒酶逆轉錄酶抗原HLA-A0201限制性CTL表位預測及鑒定

袁競妍 王宇 劉博軒 孟夏 孫瑞瑛 呂欣 李維 石婕 明宗娟 史紅陽 楊拴盈

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人端粒酶逆轉錄酶抗原HLA-A0201限制性CTL表位預測及鑒定

袁競妍1王宇2劉博軒1孟夏1孫瑞瑛1呂欣1李維1石婕1明宗娟1史紅陽1楊拴盈1

目的應用生物信息學方法對人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)HLA-A2+限制性細胞毒性T細胞(CTL)表位進行預測和鑒定，尋找誘導機體特異性殺傷肺癌腫瘤細胞的抗原表位。方法應用生物信息學軟件BIMAS、SYFPEITHI對hTERT蛋白進行HLA-A0201限制性CTL抗原表位預測，篩選優勢表位；應用肽親和力實驗、乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗及人干擾素γ(IFN-γ)ELISPOT實驗驗證表位，篩選出激發機體產生特異性免疫反應的表位。結果生物信息學軟件篩選出優勢表位為：ILAKFLHWL、ELLRSFFYV及ILSTLLCSL；肽親和力實驗得到優勢表位熒光系數(FI)為：ILAKFLHWL0.67、ELLRSFFYV0.66及ILSTLLCSL0.90；LDH釋放實驗顯示ILAKFLHWL所誘導CTLs的殺傷率明顯高于其它各表位，也明顯高于陰性表位，差異均具有統計學意義(P<0.05)；人IFN-γ ELISPOT實驗證明ILAKFLHWL所誘導的CTLs產生的IFN-γ斑點數多于其他表位，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論ILAKFLHWL的免疫原性強，可用于后續制備肺癌多肽疫苗。

支氣管肺癌； hTERT； 表位預測； 表位鑒定； 免疫

肺癌是目前發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1-2]。免疫治療已成為治療肺癌的第4種主要方法。目前已經有相關肺癌多肽疫苗進入臨床實驗如 L-BLP25[3]、CIMAVAX[4]和GV1001[5]等。這些臨床實驗均證明多肽疫苗能夠誘導針對肺癌的特異性CTL反應，且在患者體內檢測到免疫記憶細胞，患者自身對多肽疫苗的耐受性也良好[6]。目前，尋找免疫原性強并激發機體產生特異性T細胞應答的抗原已成為治療性多肽疫苗研發的焦點問題。人端粒酶(Telomerase)是能夠延長端粒末端的核糖蛋白酶，其由人端粒逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, TERT, 127KD)、端粒酶RNA分子(human telomerase RNA, hTR, 153KD)和端粒酶相關蛋白(telomerase associated protein, TP1)3個亞單位組成[7]。端粒酶中的限速成分是hTERT。目前已知在90%的以上的人類惡性腫瘤中hTERT呈高表達，而在良性組織中，hTERT表達非常低[8]。研究證實hTERT是癌細胞永生化的必要途徑，在維持腫瘤繼續分裂、增殖和生存中發揮重要作用[9]。近年來發現hTERT和腫瘤干細胞也存在密切關系。有研究結果表明，將外源性hTERT導入正常組織細胞中，可產生致瘤效果。除此之外，研究人員發現端粒酶活化和附加基因突變是正常干細胞惡性轉化為腫瘤干細胞的兩個重要條件[10]。故hTERT是腫瘤免疫治療的一個重要靶點。HLA-A2基因型在人群中分布較廣，大約50%的亞洲人及33%的非洲人和美洲人存在這種表型。因此，HLA-A2限制性的T細胞表位在免疫治療中具有很大的價值。本研究旨在對hTERT蛋白進行HLA-A0201限制性CTL抗原表位篩選及改造，獲得優勢表位，檢測優勢表位的免疫原性，篩選出1～2條免疫原性較強的表位，為制備治療性多肽肺癌疫苗奠定基礎。

材料和方法

一、細胞株及試劑

T2細胞小鼠B細胞雜交瘤細胞(TAP缺陷，HLA-A0201限制性)。購于上海富祥生物技術公司，用含10%的進口胎牛血清和1%青鏈霉素的1 640混合培養基懸浮培養。

人外周血單個核細胞(human peripheral blood mononuclear cells, PBMC)取自于HLA-A2+健康志愿者外周血，分離后用無血清培養基懸浮培養。

APC標記的鼠抗人HLA-A2抗體購于美國eBioscience公司；人β2微球蛋白(β2m)購于美國Sigma公司；重組人白介素-2凍干粉購于美國PeproTech公司。

二、實驗方法

1. 多肽合成：本實驗各候選肽均由鄭州派和泰德醫藥科技有限公司合成，并使用HPLC方法純化，合成肽的純度均在98%以上，使用質譜技術鑒定分子質量。合成的凍干粉劑用DMSO溶解為20 mmol/L的溶液，-80 ℃長期保存。實驗時，將20 mmol/L的肽溶液逐滴加入RPMI-1640培養基中配制成0.4 mmol/L的溶液，-20 ℃保存。

2. 生物信息學軟件預測hTERT： HLA-A0201限制性CTL表位：①在NCBI數據庫中對hTERT編碼蛋白質序列查詢；②應用BIMAS和SYFPEITHI軟件，在其中輸入hTERT抗原的氨基酸序列，限定條件為：長度為9個氨基酸殘基的肽段和HLA-A0201 限制性表位。預測到不同的9肽片段并對其評分。結合兩個軟件的評分結果，選擇出評分靠前的肽段用于后續研究。

3. 肽親和力實驗：即T2細胞結合實驗：①使用無血清培養基重懸為密度4×106/ml的單細胞懸液，吸取50 μl種于96孔板中，保證每孔中含有2×105個細胞；②吸取定量的β2 m，并調整其每孔的濃度為3 μg/ml；③加入實驗表位，保證每個孔實驗肽的濃度為100 μmol/L，同時設置陰性表位(AHTKDGFNF)作為陰性對照，并設置僅加溶劑和3 μg/ml的β2 m組作為空白對照，同時設置T2細胞組作為背景對照；④將96孔板置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育18 h；⑤將孵育好的細胞用0.01M的冰PBS沖洗3次，并加入5 μl APC標記的鼠抗人HLA-A2抗體，4 ℃冰箱避光孵育30 min；⑥PBS洗滌3次后用200 μl 1%的多聚甲醛溶液固定細胞至少30 min；⑦使用300目過濾布對上述溶液進行過濾。檢測流式細胞儀(美國BD公司)檢測APC的熒光強度；⑧分析數據：記錄每管流式細胞儀MFI值，以此值的高低來反映各個表位肽和T2細胞親和力的強弱。并計算FI來定量比較各個表位肽和T2細胞親和力的大小。計算公式為：熒光指數(FI)=(樣本MFI-空白對照MFI)/空白對照MFI。

4. 效應細胞的誘導：①抽取HLA-A0201陽性健康志愿者外周血，使用人淋巴細胞分離液提取PBMC，使用不含肽的混合培養基及含10 μmol/L的合成肽的混合培養基分別重懸細胞，并種于24孔板中，每孔1×106個細胞密度進行細胞接種，每孔體積1 ml；②置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養。并且每隔2 d用1 ml不含肽的混合培養基和含20 μmol/L合成肽的混合培養基分別給相應孔的細胞進行換液，換液期間每3 d補充一次10 U/ml的重組人IL-2，一共培養2周。

5. 靶細胞的誘導：對T2細胞計數，培養基重懸為1×106個/ml的細胞懸液，取6 ml細胞懸液，分為6管，每管中加入5 μl 0.4 mmol/L的不同實驗肽溶液，培養4 h后使用培養基洗滌3遍并重懸，以此細胞作為靶細胞；

6. 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放實驗：①以步驟5中的細胞作為靶細胞;②以步驟4中的PBMC作為效應細胞; ③U型96孔板中加入各種肽誘導的靶細胞100 μl。再在各孔中按效靶比5︰1～40︰1分別加入100 μl PBMC效應細胞。同時設置自然釋放組和最大釋放組。自然釋放組為100 μl靶細胞并加入100 μl培養液。最大釋放組為加入100 μl靶細胞并加入100 μl 2%Triton X-100。每個孔均設置兩個復孔; ④在酶標儀波長450 nm處檢測各孔吸光度(OD)值。LDH釋放率(%)=[ (實驗組的OD值-靶細胞自然釋放組的OD值) /(靶細胞最大釋放組的OD值-靶細胞自然釋放組的OD值)] ×100%

7. 人 IFN-γ ELISPOT實驗： ①收集步驟4的效應細胞，以離心半徑8 cm，800 r/min離心5 min，用12-725F UltraCULTURE Serum-free Medium培養基洗滌2遍，去除未結合的合成肽，用原體積的5 ml的12-725F UltraCULTURE Serum-free Medium培養基重懸，制備成原細胞密度的細胞懸液; ②取出預包被的人IFN-γ ELISPOT 試劑盒中的PVDF96孔板，每孔加入200 μl的12-725F UltraCULTURE Serum-free Medium培養基，室溫靜置孵育10 min，將其在高壓滅菌的吸水紙上扣出; ③將效應細胞按每孔5×104個(50μl細胞懸液)接種于各個孔中。同時設只含12-725F UltraCULTURE Serum-free Medium培養基的空白對照組；④將上一步驟中各個孔分為三個部分:第一部分，效應細胞中分別加入10 μl 25 μg/ml的PHA溶液，用12-725F UltraCULTURE Serum-free Medium培養基補足至100 μl; 第二部分，效應細胞中分別加入50 μl靶細胞懸液，作為實驗組; 第三部分，效應細胞中分別加入50 μl結合對應肽抗體封閉的靶細胞懸液，作為抗體封閉組; ⑤蓋好板蓋，置于37 ℃ 5% CO2孵箱中培養18 h。并按照深圳達科為公司的人IFN-γ ELISPOT試劑盒說明加入相應試劑; ⑥將板及其底座分開在室溫陰涼通風處自然晾干。將板寄予深圳達科為生物技術有限公司，進行讀板。

三、統計學方法

結 果

一、HLA-A0201限制性CTL表位的生物信息學預測

1. NCBI數據庫上查詢hTERT蛋白質序列：查詢得到1 132個氨基酸序列，如下:

1mpraprcravrsllrshyrevlplatfvrrlgpqgwrlvqrgdpaafralvaqclvcvpw

61darpppaapsfrqvsclkelvarvlqrlcergaknvlafgfalldgarggppeafttsvr

121sylpntvtdalrgsgawglllrrvgddvlvhllarcalfvlvapscayqvcgpplyqlga

181atqarppphasgprrrlgcerawnhsvreagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprr

241gaapepertpvgqgswahpgrtrgpsdrgfcvvsparpaeeatslegalsgtrhshpsvg

301rqhhagppstsrpprpwdtpcppvyaetkhflyssgdkeqlrpsfllsslrpsltgarrl

361vetiflgsrpwmpgtprrlprlpqrywqmrplflellgnhaqcpygvllkthcplraavt

421paagvcarekpqgsvaapeeedtdprrlvqllrqhsspwqvygfvraclrrlvppglwgs

481rhnerrflrntkkfislgkhaklslqeltwkmsvrgcawlrrspgvgcvpaaehrlreei

541lakflhwlmsvyvvellrsffyvtettfqknrlffyrksvwsklqsigirqhlkrvqlre

601lseaevrqhrearpalltsrlrfipkpdglrpivnmdyvvgartfrrekraerltsrvka

661lfsvlnyerarrpgllgasvlglddihrawrtfvlrvraqdpppelyfvkvdvtgaydti

721pqdrlteviasiikpqntycvrryavvqkaahghvrkafkshvstltdlqpymrqfvahl

781qetsplrdavvieqssslneassglfdvflrfmchhavrirgksyvqcqgipqgsilstl

841lcslcygdmenklfagirrdglllrlvddfllvtphlthaktflrtlvrgvpeygcvvnl

901rktvvnfpvedealggtafvqmpahglfpwcgllldtrtlevqsdyssyartsirasltf

961nrgfkagrnmrrklfgvlrlkchslfldlqvnslqtvctniykilllqayrfhacvlqlp

1 021fhqqvwknptfflrvisdtaslcysilkaknagmslgakgaagplpseavqwlchqafll

1 081rhrvtyvpllgslrtaqtqlsrklpgttltaleaaanpalpsdfktild

BIMAS軟件預測表位及得分結果：通過軟件預測可知，得分前10位的表位，見表1。

表1 BIMAS軟件預測hTERT CTL天然表位得分表

SYFPEITHI軟件預測預測表位及得分結果：通過軟件預測可知，得分前10位的表位，見表2。

表2 SYFPEITHI軟件預測hTERT CTL天然表位得分表

綜合兩種軟件預測結果，最終選取了表位ILAKFLHWL、ELLRSFFYV及ILSTLLCSL用于后續研究。

二、肽親和力實驗

通過各表位的平均熒光強度來計算熒光系數(FI)，通過對FI的比較來決定各合成肽和HLA-A2親和力的高低，FI越高，則表位和HLA-A2分子的親和力越強，其計算公式為：FI=(樣本MFI-空白對照MFI)/空白對照MFI。各表位FI見表3，由表3可知，表位P1、P2及P3的FI之均高于陰性表位，說明這3個表位和T2細胞的親和力均較高。因此P1、P2及P3均納入之后的實驗。

表3 各實驗肽熒光系數

三、LDH釋放實驗

由圖1知P2的LDH釋放率較高，且在效靶比10︰1～40︰1范圍內隨著效靶比升高，其LDH釋放率也隨之提高。肽P1的LDH釋放率也隨著效靶比的升高而升高，和陰性肽相比差異不具有統計學意義(P>0.05)；肽P3所誘導的PBMC在效靶比5︰1至20︰1時處于下降狀態，在效靶比40︰1時升高，和陰性肽相比差異不具有統計學意義(P>0.05)；在效靶比為5︰1和10︰1時，各肽之間兩兩比較，LDH釋放率差異無統計學意義(P>0.05)，各肽和陰性肽相比差異也不具有統計學意義；在效靶比為20︰1和40︰1時，肽P2的LDH釋放率明顯高于其它各肽，也明顯高于陰性肽，差異具有統計學意義(P<0.05)，而肽P1和肽P3的LDH釋放率和陰性肽比較差異無統計學意義(P>0.05)。因此可知肽P2和肽P1、P3相比，能夠誘導CTL產生更強的殺傷效應。

圖1 LDH釋放實驗結果

表4 CTL分泌的 IFN-γ斑點數(單位：個)

注：a實驗組和抗體封閉組比較，P<0.05；b肽P1及肽P2的實驗組和肽P3組、陰性組比較，P<0.05

四、ELISPOT實驗

PHA組的結果，示肉眼觀察各表位誘導的斑點密集，讀板計數在440～500個之間，多于陰性肽誘導的斑點數364.67±18.72個，而無肽誘導的CTL斑點數為388.33±34.02個，說明實驗肽和陰性肽存在差異，并且該試劑盒系統反應正常。

實驗組和抗體封閉組的斑點數稀疏， 寄予公司讀板。讀板結果見表4。合成肽P1實驗組斑點數為14.67±0.58個，抗體封閉組斑點數為8.00±1.00個；合成肽P2實驗組斑點數為28.00±5.00個，抗體封閉組斑點數為9.00±2.65個。肽P1和肽P2實驗組和抗體封閉組斑點數的差異具有統計學意義(P<0.05)；合成肽P3及陰性肽實驗組斑點數多于抗體封閉組，但差異無統計學意義(P>0.05)。肽P1和肽P2的實驗組與肽P3及陰性肽實驗組比較，斑點數差異也具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

此實驗說明合成肽P2比合成肽P1和合成肽P3相比，能夠誘導出CTL細胞分泌出更多的IFN-γ，也說明合成肽P2誘導的CTL具有更強的特異性殺傷能力。

圖2 CTL分泌的 IFN-γ斑點數；注：*實驗組和抗體封閉組比較，P<0.05；#肽P1及肽P2的實驗組和肽P3組、陰性組比較，P<0.05；

討 論

惡性腫瘤疫苗的主要成分是肽、蛋白、重組載體及腫瘤細胞等具有免疫原性的腫瘤相關抗原，通過抗原提呈細胞的提呈和免疫佐劑輔助，達到增強疫苗免疫原性的目的。在此基礎再應用預處理方案，如使用疫苗治療時使用小劑量化療藥物進行預處理或是聯合細胞因子進行免疫刺激[11]，可進一步提高疫苗抗惡性腫瘤能力。

由以上理論可知，在制備腫瘤疫苗時，首先需找到具有免疫原性的腫瘤相關抗原。hTERT作為端粒酶的催化亞基，且是合成端粒酶的限速因素，對維持端粒的長度具有重要作用。眾所周知，端粒酶以自身RNA為模板并延長后隨鏈模板3′端，防止因為不完全復制而引起的染色體DNA短縮[12]。而在惡性細胞及永生化的細胞中，由于端粒酶的激活引起端粒長度的維持是引起癌細胞無限復制的重要因素。因此本實驗通過生物信息學對hTERT全長度氨基酸序列進行預測及篩選，篩選出理論上可能具有較強免疫原性的表位作為腫瘤相關抗原，并通過實驗比較所篩選多肽誘導CTL的殺傷能力，為今后制備治療性肺癌疫苗尋找強免疫原性表位。

hTERT表位疫苗能夠誘導良好的免疫應答。p540是研究較多的HLA-A0201限制性的天然表位。已有研究證明p540能夠激發特異性針對HLA-A2+腫瘤細胞的特異性免疫應答；在HHD轉基因小鼠體內，使用(p540+IFA)注射小鼠后，也觀察到相似的CTL反應[13]。更為重要的是，并未觀察到p540對正常細胞具有攻擊性。不僅p540，p572(序列為RLFFYRKSV)，p865(序列為RLVDDFLLV)也被鑒定出能夠誘導出HLA-A2特異性CTL反應。

本實驗中，我們應用BIMAS、SYFPEITHI軟件聯合評分預測的方法來篩選出理論上具有強免疫原性的HLA-A0201 CTL天然表位。通過綜合評分可知，540-548位點的ILAKFLHWL(即本文編號P2)表位在天然表位的評分中處于第一，在BIMAS評分為1 745.714分，在SYFPEITHI軟件中評分為30分；排名第二的表位為ELLRSFFYV，位于555-563位點。其在BIMAS評分為1 169.81分，在SYFPEITHI軟件中評分為17分；而位于836-844位點的表位ILSTLLCSL雖在BIMAS評分僅有83.53，但其在SYFPEITHI中評分為29分，因而也納入其進行下一步實驗。

肽親和力實驗通常用來測定表位和MHC分子的親和力。在體內正常特異性免疫過程中，CTL表位需要APC的提呈才能與MHCⅠ類分子結合，進而結合TCR引起T細胞應答，而此免疫應答強弱依賴于表位肽和MHC Ⅰ類分子之間親合力的大小，較高免疫原性的抗原均具有較強的親合力[14]。T2細胞是一個TAP缺陷的細胞，它不能提呈抗原，因此其表面的MHCⅠ類分子的表達極其不穩定，但是在低溫條件或是外源性表位結合條件下，MHCⅠ分子可以暫時穩定表達。通過以上理論可知，若表位和MHCⅠ親和力越強，其表面表達MHCⅠ類分子量越多。本實驗在肽濃度均為100 μmol/L的條件下通過對HLA-A0201分子熒光強度的檢測，P1、P2及P3的FI分別是：0.66、0.67和0.90，均高于陰性表位FI。

表位誘導出CTL的殺傷能力主要通過LDH釋放實驗和ELISPOT實驗評價。CTL是最主要的抗腫瘤效應細胞，它能直接溶解腫瘤細胞，分泌一系列細胞因子，如IFN-γ、TNF和GM-CSF等，增強機體對腫瘤的免疫反應。ELISPOT實驗則是直接檢測CTL產生的IFN-γ斑點數來證實CTL殺傷能力。本實驗通過對各表位孵育的PBMC誘導的CTL釋放IFN-γ斑點數比較，發現肽P1和肽P2產生的斑點數實驗組明顯多于實驗抑制組，差異具有統計學意義(P<0.05)。肽P3實驗組和實驗抑制組所誘導的CTL釋放IFN-γ斑點數差異不明顯，不具有統計學意義(P>0.05)。LDH釋放實驗中，可以看出肽P2和肽P1誘導的T2細胞LDH的釋放具有明顯的效靶比依賴性，且肽P2在效靶比20︰1和40︰1時的LDH釋放率明顯多于陰性肽組及其它組，差異具有統計學意義(P<0.05)，而肽P1、肽P3分別和陰性肽相比，LDH釋放率結果差異不具有統計學意義(P>0.05)。

綜合分析肽P2即ILAKFLHWL具有更優的免疫原性。本研究針對hTERT相關肺癌多肽疫苗的制備提供了有力基礎。同時為肺癌分子靶向治療提供臨床參考依據[15]。

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(本文編輯：王亞南)

袁競妍，王宇，劉博軒，等. 人端粒酶逆轉錄酶抗原HLA-A0201限制性CTL表位預測及鑒定[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(3)： 257-262.

Prediction and identification of HLA-A0201 restricted CTL epitopes derived from human telomerase reverse transcriptase antigen

YuanJingyan1,WangYu2,LiuBoxuan1,MengXia1,SunRuiying1,LyuXin1,LiWei1,ShiJie1,MingZongjuan1,ShiHongyang1,YangShuanying1.

1DepartmentofRespiratoryMedicine;2Departmentofcardiacsurgical,thesecondaffiliatedhospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China

YangShuanying,Email:Yangshuanying66@163.com

Objective HLA-A0201 restricted epitopes were screened for the hTERT protein, and the dominant epitopes were obtained. Then the immunogenicity of the dominant epitopes were detected, finally 1-2 stronger epitopes were acquired which could induced stronger immune response. Method applied bioinformatics software BIMAS and SYFPEITHI to predict hTERT protein HLA-A0201 restricted CTL epitopes. Then screened dominant epitopes according to the score of two kinds of software. Next, applied peptide affinity experiment, lactate dehydrogenase(LDH) release assay as well as human interfron gamma(IFN-γ) ELISPOT epitope screening experiments to veriify dominant epitopes. Finally, acquired the epitopes which had ability to elicit stronger immune respons. Results Comprehensive analysis of SYFPEITHI software and BIMAS software for HLA-A0201 restricted CTL antigen epitope prediction of hTERT protein showed that 3 peptides were better than others. They were ILAKFLHWL, ELLRSFFYV and ILSTLLCSL. The result of peptide affinty experiment showed that the fluorescence index(FI) of each peptide was ILAKFLHWL 0.67, ELLRSFFYV 0.66 and ILSTLLCSL 0.90; The result of LDH releasing assay showed that the killing rate of ILAKFLHWL was significantly higher than other peptides and negative peptide(P<0.05); The result of human IFN-γ ELISPOT test showed that the number of spots elicited by ILAKFLHWL epitope was significantly higher than other epitopes(P<0.05). Conclusions The PBMCs cells induced by epitope ILAKFLHWL had a most significant killing effect. The epitope ILAKFLHWL could be used to make lung cancer poly-peptide vaccine.

Bronchogenic lung carcinoma; hTERT; Epitope prediction; Immune

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.003

國家自然科學基金資助項目(81172234) 陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2014KTCL03-02) 中央高校基本科研業務費交叉重點項目(XKJC2015001)

710004，西安，西安交通大學第二附屬醫院呼吸內科1、心臟外科2

楊拴盈， Email: yangshuanying66@163.com

R734.2

A

2017-05-08)