下調S100A6基因對裸鼠肺腺癌移植瘤生長和凋亡的影響

南巖東 姜華 房延鳳 金發光 楊拴盈

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·論著·

下調S100A6基因對裸鼠肺腺癌移植瘤生長和凋亡的影響

南巖東1姜華1房延鳳1金發光1楊拴盈2

目的探討下調靶向基因S100A6對在體肺腺癌移植瘤生長和凋亡的影響。方法18只健康Balb/c雄性裸鼠隨機分為空載體對照組、陰性對照組及S100A6 基因RNA干擾組三組，每組6只動物；分別應用不攜帶目的基因的空載質粒、未轉染任何質粒以及含有S100A6基因RNA干擾慢病毒質粒的A549肺腺癌細胞接種于裸鼠皮下，構建移植瘤動物模型；觀察不同組移植瘤組織生長情況；采用Real-Time PCR、免疫組織化學及Western-blot等技術檢測S100A6 mRNA和蛋白的表達，TUNEL法檢測細胞凋亡。結果成功構建了裸鼠肺腺癌皮下移植瘤模型；病理學特征顯示，陰性對照組和空載體對照組可見到成巢的腫瘤細胞，癌細胞核大，而干擾組腫瘤細胞較稀疏，間質組織明顯；接種細胞2周時，陰性對照組、空載體對照組和RNA干擾組腫瘤組織體積和質量差異具有統計學意義(P<0.05)；S100A6基因和蛋白表達在三組之間差異具有統計學意義(P<0.05)；各組裸鼠移植瘤凋亡細胞呈現不同程度的棕褐色腫瘤細胞核，三組腫瘤細胞凋亡率的差異具有統計學意義(P<0.05)。結論下調腫瘤瘤組織S100A6蛋白表達，可抑制腫瘤生長，誘導細胞凋亡，為進一步開發肺腺癌分子靶點提供了新途徑。

S100A6； 肺腺癌； 生長移植病； 細胞凋亡

原發性支氣管肺癌(簡稱肺癌)發病機制不明，生物學行為極端惡性，缺乏有效的預測生物標志物。近年來發現，一類具有EF-手型模序結構的S100鈣結合蛋白家族通過與靶蛋白的相互作用，啟動細胞信號轉導，參與細胞生長、分化、細胞周期及胞外基質分泌等多種生物學過程，并與腫瘤發生、發展及轉移預后相關[1-2]。我們前期的研究證實，鈣結合蛋白家族成員之一S100A6可在肺腺癌組織中表達明顯上調，影響肺癌的生存與預后[3]。為進一步探討S100A6 在體內參與肺腺癌惡性表型的生物學過程的作用特點，本研究應用反義寡核苷酸技術敲除人肺腺癌A549細胞S100A6基因表達，建立肺腺癌荷瘤裸鼠模型，觀察裸鼠移植瘤成瘤情況，旨在探討S100A6基因表達及其對腫瘤細胞凋亡的影響，為明確S100A6基因對肺腺癌生物學行為影響的作用機制提供理論依據。

資料與方法

一、實驗材料

二、主要試劑

RPMI 1640培養基(購自GIBCO)、胎牛血清(購自TBD)、雙抗(青霉素、鏈霉素)，胰酶(購自北京賽馳生物)、AxyPrep質粒小量制備試劑盒(Axygen公司)，T4 DNA連接酶(NEB公司)，NucleoBondXtra Midi Plus(MACHEREY-NA GEL公司)，限制性內切酶BamH I、EcoR I、Kpn I，SYBR○RGreen I(Takara公司) ， BSA(Sigma公司)，高效感受態細胞制備試劑盒(Sagon公司)。

三、實驗步驟

1. 重組慢病毒質粒感染A549肺腺癌細胞: 制備S100A6基因RNA干擾慢病毒載體，慢病毒顆粒的包裝，逐孔稀釋法病毒滴度測定。將人肺腺癌A549細胞培養于含100 g/L胎牛血清的RPMI1640培養液中，取第三代處于對數生長期A549細胞接種于6孔培養板中，待細胞生長融合約60%左右進行轉染。共分為3組：①空載體對照組：轉染只攜帶GPH而不攜帶目的基因的空載質粒；②陰性對照組：未轉染任何質粒；③S100A6 RNA干擾組(pLenR-GPH- shRNAi-S100A6)：轉染干擾目的基因及GPH質粒。病毒感染96 h后用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光(green fluorescence protein, GFP)，以觀察病毒對目的細胞的感染情況，感染效率=熒光細胞數/總細胞數×100%。

2. 肺腺癌裸鼠種移植瘤模型的建立: 本研究動物成瘤參照Shen等[4]建立的方法，將三組對數生長期的細胞，用胰酶消化，完全培養基中止，收集細胞沉淀后，洗一次，離心后用無血清的重懸，調成細胞密度為5×107。將18只裸鼠隨機分為三組，分別為: 空載體對照組, 陰性對照組, S100A6 RNA干擾組，每組6只，每只裸鼠分別于背部及腋部皮下三個部位注射相應的細胞約200 μl，種植腫瘤細胞數5×107，每組接種18個部位。

3. 動物成瘤觀察: 自細胞接種之日起，觀察三組裸鼠種植瘤的生長，待腫瘤出現后用游標卡尺測量腫瘤的大小，長徑用a表達，短徑用b表示，腫瘤的體積則用V=1/2ab2計算。第14天將所有裸鼠處死，取出瘤塊測量體積，稱重。常規石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察細胞結構與形態。

4. Real-Time PCR 檢測移植瘤S100A6基因表達: 組織冰上勻漿: 4 ℃，以離心半徑8 cm，12 000 min離心5 min；小心倒掉上清液，空干RNA沉淀；在RNA沉淀中加入適量的DEPC水、1 μl DNaseI (RNase free)和相應酶buffer于37 ℃水浴30 min，溶解RNA并除去RNA中的基因組DNA污染；按照Trizol說明書提取RNA，取適量RNA樣品，用核酸蛋白定量儀測定OD260/OD280值和濃度，同時取適量RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳以鑒定RNA的質量，然后保存于-80 ℃冰箱。測定總RNA的純度，將RNA逆轉錄為cDNA，以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化PCR擴增。S100A6上游引物：5′-ATGGCATG CCCCCTGGAT-3′，下游引物為：5′-TGAGGGCTTCATTGTAGATC-3′； 熒光定量PCR擴增條件的設置：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s 60 ℃30 s；72 ℃ 30 s循環35次，72 ℃檢測信號。

5. 免疫組化檢測S100A6表達: 腫瘤組織均經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚連續切片。免疫組化染色按試劑盒說明進行：石蠟切片經脫蠟、水化，3% H2O2室溫孵育15 min封閉內源性過氧化物酶，PBS 漂洗、加封閉液孵育15 min后，一抗滴加后4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木素復染。陽性細胞數分級標準參考Sato等[5]方法，陽性細胞10%以下為0分，10%～49%為1分，50%～69%為2分，≥70%為3分；信號強弱的判斷標準：低或者基本無顯色為0分，弱陽性為1分，陽性為2分，強陽性為3分；兩項評分相乘，≤2為低表達(+)，3～4為中表達(++)，6～9為高表達(+++)。

①病人的一系列的行為舉止和本研究中提到的病的是一樣的。②癡傻的一百八十天里面有過中風，癡傻的時間超過了三百六十天。③雖然人格的要素還比較完整，但是沒辦法準確的獲取外界信息，現象具有階梯的特征。④中風出現過多次，沒辦法以正常的狀態行走。⑤有很大的幾率后面會得腦血管這個病。

6. Westerrn-blot檢測S100A6蛋白表達: Wester-blot參考Ishii A等[6]所應用的方法，組織剪切成細小的碎片，每100毫克組織加入1 ml RIPA裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，將勻漿物轉移到1.5 ml離心管，12 000×g，4 ℃離心5 min，取上清，采用BCA進行蛋白質定量后置-80 ℃貯存備用；灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，半干法電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，加入兔抗人S100A6多克隆抗體(1︰200稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST溶液洗膜3次，加入過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1︰2 000)，37 ℃孵育2 h；化學發光法顯色，圖像經Uvpgrabit Image軟件測定各條帶的吸光度，以S100A6/GAPDH條帶積分光密度值的比值表示S100A6蛋白的相對表達量。

7. TUNEL凋亡分析: 石蠟切片常規脫蠟至水，蒸餾水振洗，蛋白酶K 消化，按TUNEL檢測試劑盒說明進行操作。光學顯微鏡觀察，細胞核內出現深棕色顆粒為凋亡陽性表現，隨機觀察5個高倍視野，每個視野連續計數100個細胞的凋亡細胞數，以平均數為凋亡指數( apoptotic index, AI) 。

結 果

一、A549肺腺癌細胞病毒感染效率

重組慢病毒感染A549肺腺癌細胞后，通過熒光顯微鏡觀察穩定感染細胞系的GFP表達情況。結果顯示，隨著時間的增加，熒光表達逐漸增強，至72 h表達最強；熒光顯微鏡下觀察發出綠色熒光的細胞數量，經計算慢病毒感染，感染A549細胞效率為87.50%，可以用于后續相關實驗，見圖1。

二、動物成瘤觀察

接種細胞兩周時裸鼠可見腫瘤的生長，其中S100A6 RNA干擾組有6只裸鼠均發現有腫瘤生長，接種腫瘤細胞的18個部位中有11個出現腫瘤病灶，成瘤率為61.1%；空載體對照組6只裸鼠成瘤全部成瘤，16個部位出現腫瘤病灶，成瘤率為88.9%，陰性對照組15個部位出現腫瘤病灶，成瘤率為83.3%，見圖2。三組成瘤率差異無統計學差異(P>0.05) 。成瘤第14天將所有裸鼠處死，取出所有腫瘤組織，測得陰性對照組、空載體對照組和S100A6 RNA干擾組腫瘤組織體積分別是(0.2988±0.0352)cm3，(0.3127±0.0356)cm3和(0.1479±0.0480)cm3，三組之間體積差異具有統計學意義(P<0.05)；陰性對照組、空載體對照組和S100A6 RNA干擾組腫瘤組織質量分別是(0.3137±0.0349)mg，(0.3277±0.0371)mg 和 (0.1517±0.0413)mg，三組之間腫瘤質量的差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 三組裸鼠接種A549肺腺癌細胞14天成瘤腫瘤組織體積及質量比較；注：A：體積比較；B：質量比較；1：陰性對照組；2：空載體對照組；3：S100A6 RNA干擾組；*與陰性對照組相比，P<0.05；#與空載體對照組相比，P<0.05

三、HE染色觀察腫瘤組織病理

移植瘤組織切片HE染色，光鏡下觀察病理學特征，陰性對照組和空載體對照組腫瘤可見到成巢的腫瘤細胞，癌細胞核大、異型、濃染、核仁突出，干擾組腫瘤細胞較稀疏，間質組織明顯，核異型性明顯，見圖4。

四、Real-Time PCR 檢測移植瘤S100A6基因表達

應用Real-Time PCR技術檢測移植瘤組織S100A6蛋白基因表達，陰性對照組為0.047±0.018，空載體對照組為0.040±0.008，RNA干擾組0.018 ±0.006,三組之間差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 Real-time PCR檢測移植瘤組織S100A6mRNA表達；注：三組mRNA相對表達比較；*與陰性對照組相比，P<0.05；#與空載體對照組相比，P<0.05

五、S100A6表達免疫組織化學分析

S100A6 蛋白的免疫著色主要位于細胞質和細胞膜，腫瘤間質和細胞核未見染色。陰性對照組S100A6低表達2例(33.3%)，中表達4例(66.7%)，無高表達；空載體對照組低表達1例(16.7%)，中表達5例(83.3%)，無高表達；RNA干擾組低表達5例(83.3%)，中表達1例(16.7%)，無高表達，見表1和圖6。

表1 應用免疫組織化學法檢測S100A6在三組移植瘤腫瘤組織差異表達

六、S100A6表達Western-blot分析

Western-blot免疫印跡條帶結果顯示，S100A6蛋白相對表達量在陰性對照組為0.313±0.120，空載體對照組0.349±0.104，RNA干擾組0.132±0.057，三組間差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 Western-blot檢測裸鼠成瘤S100A6蛋白表達；注：A: western-blot 電泳條帶，1-1 陰性對照組，2-1空載體對照組，3-1 RNA干擾組；B:S100A6蛋白相對表達量比較，*與陰性對照組相比，P<0.05，#與空載體對照組相比，P<0.05

七、TUNEL 法檢測移植瘤細胞凋亡

各組裸鼠移植瘤凋亡細胞呈現不同程度的棕褐色染色腫瘤細胞核(圖7A、B、C所示)， RNA干擾組與陰性對照組和空載體對照組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)，而陰性對照組和空載體對照組比較差異均無統計學意(P>0.05)，見圖8。

討 論

S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrlich腹水瘤中檢出，主要存在于胞質、胞膜以及核被膜上。S100A6基因位于人染色體的lq21的250～350 kb之間，并與S100A1～5、S100A7～10，S100C等S100基因家族成員、表皮分化基因及原癌基因ski比鄰。生理狀態下S100A6的分布受鈣離子濃度的影響，在G0期到S期時達最高水平，與細胞進入S期有關[7]，但在組織發生惡性變時其表達明顯失控[8]。研究顯示，S100A6在人急性粒細胞白血病、人子宮內膜癌、乳腺癌、肺癌、結直腸腫瘤、甲狀腺腫瘤、惡性纖維組織瘤、黑色素細胞瘤、神經母細胞瘤、口腔黏膜的鱗狀細胞癌、各種類型的皮膚腫瘤以及上皮來源的腫瘤細胞系等多種增殖旺盛的細胞中均高表達[9]。我們前期的研究發現，S100A6在肺腺癌中表達顯著高于正常肺組織[10-11]，但是S100A6基因在體內影響肺腺癌的發生、發展相關機制目前尚不清楚。

本研究首先通過S100A6基因RNA干擾慢病毒載體轉染肺腺癌A549細胞，隨后將含有S100A6基因干擾序列腫瘤細胞懸液接種于健康Balb/c雄性裸鼠，建立了裸鼠皮下移植瘤模型。實驗結果顯示，與陰性對照組和空載體對照組比較，RNA干擾組S100A6基因和蛋白表達顯著下調；三組在動物成瘤率無差異，但RNA干擾組的移植瘤體積和質量均顯著低于對照組，提示S100A6基因敲除可誘發細胞增殖相關蛋白的下調，顯著影響腫瘤細胞生長，降低腫瘤細胞的增殖能力。Yamaguchi等[12]在對MLL-AF4和Fms樣酪氨酸激酶3對白血病協同作用機制的研究中發現，增強表達的S100A6在MLL-AF4相關的白血病生成中具有重要作用，而反義S100A6小干擾RNA 可下調白血病細胞增殖。Omnicki 等[13]發現在S100A6基因缺陷的骨母細胞及胰腺癌細胞，其增殖能力明顯也受到抑制。

DNA損傷是細胞凋亡過程中必經環節之一，細胞凋亡時胞內核酸內切酶活化，后者將DNA鏈在核小體間連接區切成缺口，使核內DNA斷裂成小片斷。在組織細胞原位DNA切口可被脫氧核糖核酸轉移酶末端標記，因此應用DNA片段原位末端標記技術(TUNEL)可及時發現細胞DNA斷裂損傷，反應細胞凋亡情況。研究發現，S100A6是也一個細胞周期和凋亡相關蛋白。Matsumoto等[14]發現S100A6 mRNA 在人上皮來源的腫瘤細胞系，如口腔鱗癌、黑色素瘤的S期表達增加，G1/G2 期表達降低，它在腫瘤細胞受某些生長抑制劑VP-16 和佛波酯的作用生長變慢時表達降低。本實驗采用TUNEL方法檢測裸鼠移植瘤組織腫瘤細胞凋亡情況，發現腫瘤組織細胞核可呈現不同程度的棕褐色染色，提示為凋亡細胞；RNA干擾組與陰性對照組和空載體對照組比較，凋亡細胞明顯增加，表明通過干預S100A6基因表達有可抑制腫瘤增殖與發展。

圖8 TUNEL法檢測移植瘤凋亡細胞及各組凋亡細胞數比較；注：A：陰性對照組，B：空載體對照組， C：RNA干擾組，D：各組凋亡細胞數比較， *與陰性對照組相比，P<0.05，#與空載體對照組相比，P<0.05(×400)

S100A6在蛋白質或mRNA上調受多個細胞因子的調控，包括血小板源生長因子、表皮生長因子、腫瘤壞死因子、維甲酸等[15-16]；S100A6基因也可間接通過與p53相互作用抑制其轉錄，調控細胞的增值和凋亡[17-18]。Slomnicki 等[19]應用親和色譜法和免疫共沉淀技術發現S100A6可引起p53轉錄活性增高，誘導細胞對凋亡敏感性增加，同時應用電泳遷移率變動分析發現S100A6并沒有影響p53與DNA結合。本研究結果顯示，應用S100A6基因RNA干擾構建的裸鼠移植瘤動物模型，可通過下調腫瘤瘤組織S100A6蛋白表達，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤生長，為進一步研發肺腺癌分子靶點提供了新的途徑。

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(本文編輯：張大春)

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Influence of S100A6 gene down-regulation on growth and apoptosis of transplanted lung adenocarcinoma in nude rats

NanYandong1,JiangHua1,FangYanfeng1,JinFaguang1,YangShuanying2.

1DepartmentofRespiratoryDisease,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China;2DepartmentofRespiratoryDisease,SecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China

NanYandong,Email:nanyandong2008@163.com

Objective S100A6 can regulate cell proliferation, differentiation, cell cycle and apoptosis by interacting with target proteins under the condition of calcium ion existence. S100A6 gene is highly expressed in multiple tumor tissues and is closely related to the occurrence and development of tumor. The aim of this study is to explore the influence of S100A6 gene down-regulation on growth and apoptosis of transplanted lung adenocarcinoma in nude rats. Methods Eighteen healthy male Balb/c nude mice were randomly divided into three groups: empty vector control group (n=6), negative control group (n=6) and S100A6 gene RNA interference (RNAi) group (n=6). The transplanted lung adenocarcinoma models were established by subcutaneous injection of A549 lung adenocarcinoma cells line with empty vector, non-carrier vector and pLenR-GPH-shRNAi-S100A6, respectively. The growth of transplanted tumor in different groups was observed. The expression of S100A6 gene was detected using real-time PCR, immunohistochemistry and western-blot methods. Apoptosis cells were analyzed by Terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL). Results The transplanted lung adenocarcinoma models in nude rat were successfully established. The pathological features showed that typical tumor cells formed solid hest-like mass. The tumor cell nucleus in empty vector control group and negative control group got bigger. The tumor cells in S100A6 RNAi group were relatively looser and their interstitial components became obvious. The tumor volume and mass among three groups had significant difference(P<0.05). The expression of S100A6 gene of RNAi group was significantly lower than that of empty vector control group and negative control group(P<0.05). The apoptosis rate had significantly difference among three groups(P<0.05). The nucleus of apoptosis cell in transplanted lung adenocarcinoma showed brown. Conclusions Down-regulation expression of S100A6 in lung adenocarcinoma could inhibit tumor growth and induce cell apoptosis, which could provide new pathway for further study of molecular target spot of lung adenocarcinoma.

S100A6; Lung adenocarcinoma; Growth transplant disease; Apoptosis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.002

國家自然科學基金資助項目(81001040)

710038 西安，第四軍醫大學唐都醫院呼吸與危重癥醫學科1710004 西安，西安交通大學第二附屬醫院呼吸內科2

南巖東，Email：nanyandong2008@163.com

R563

A

2016-01-03)