基于三維打印和組織工程技術構建人陰莖形態軟骨支撐體

袁兆遠 寧進 陳潔 夏會堂 陶然 周廣東 肖開顏 曹誼林

·論著·

基于三維打印和組織工程技術構建人陰莖形態軟骨支撐體

袁兆遠 寧進 陳潔 夏會堂 陶然 周廣東 肖開顏 曹誼林

目的探討基于三維打印和組織工程技術構建人陰莖形態軟骨支撐體的可行性。方法應用三維打印技術制備人陰莖形態聚己內酯/羥基磷灰石（PCL/HA）內核，并在外層包被聚羥基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）細胞支架，組裝成人陰莖形態三維復合支架。獲取乳豬關節軟骨細胞，培養、擴增至第1代，收取細胞，接種至復合支架，體外培養4周后植入裸鼠皮下，體內8周后取材，進行大體及組織學觀察。結果人陰莖形態復合支架形態逼真，植入裸鼠體內8周后，再生出人陰莖形態的軟骨支撐體，支撐體表面形成均質、成熟的軟骨層，軟骨層與內核支架融合良好。結論基于三維打印和組織工程技術，可形成內核為PCL/HA支架，外層包被成熟軟骨的人陰莖形態軟骨支撐體。

組織工程三維打印復合支架陰莖軟骨

陰莖是男性重要的泌尿、生殖器官，具有排尿、排精和性交功能。因先天性畸形或創傷、腫瘤等導致的部分或完全缺損，使患者喪失排尿、性交能力的同時，給患者帶來沉重的心理傷害[1]。陰莖缺損的治療主要是陰莖再造術，皮瓣包裹軟骨支撐體是基本的方法，合適的陰莖支撐體是決定手術成敗的關鍵因素之一。陰莖支撐體主要有兩大類：自體軟骨或骨，以及人工陰莖假體[2-4]。自體軟骨或骨移植，破壞供區解剖結構，甚至可引起供區功能障礙；而由惰性材料制成的人工假體，則存在免疫排斥、生物相容性差等問題。組織工程的快速發展為臨床陰莖再造提供了新的思路[5]。

各類軟骨缺損（如關節、氣管等）的組織工程修復技術均已在動物體內獲得了初步成功[6-7]，其中關節軟骨缺損修復已實現了初步的臨床轉化[8]。因此，本研究嘗試以組織工程技術，并輔以三維打印技術，構建陰莖形態軟骨支撐體，為臨床陰莖再造提供更為合適的軟骨支持體。

聚羥基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）是軟骨構建常用的細胞支架材料[9-11]，但是其力學強度不足，難以滿足陰莖軟骨支撐體對強度的需求；構建大體積的軟骨還會出現中心部分營養不足，難以形成成熟軟骨。聚己內酯（PCL）具有良好的組織相容性，力學強度高，并可調整，易塑形，可進行三維打印。但是，PCL缺乏細胞親和位點，限制了其作為細胞支架的應用[12-15]。我們利用PGA/PLA的成軟骨優勢和PCL高強度、易塑形的特點，制作組裝成內部為三維打印的陰莖形態PCL/HA內核（混入HA用以調整、維持材料強度），外部包被預先塑形的薄層多孔PGA/ PLA細胞支架，并嘗試以此構建人陰莖軟骨支撐體。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5只雌性裸鼠（上海甲干生物科技有限公司）。實驗過程中均依照實驗動物保護指南的要求進行。

1.2 實驗材料及設備

高糖DMEM培養基（Gibco公司，美國）；胎牛血清，磷酸鹽緩沖液，胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Worthington公司，美國）；無紡PGA纖維（組織工程國家工程研究中心）；聚乳酸（PLA，濟南岱罡生物工程有限公司）；聚己內酯（PCL）/羥基磷灰石（HA）復合材料（上海交通大學材料學院）；硅橡膠（3M公司，美國）。

三維打印熔融噴絲雙噴頭成型機（上海富奇凡機電科技有限公司）；混料機（Plastograph EC，Brabender公司，德國）。

1.3 原代細胞的獲取及擴增

軟骨取自新生乳豬髖、膝關節，將軟骨塊剪碎，加入0.25%Ⅱ型膠原酶，37℃震蕩消化7～8 h，用100 μm細胞濾網過濾，離心，去上清液。沉淀的細胞用高糖DMEM培養基重懸，以1×104cells/cm2的濃度接種于100 mm培養皿上。在37℃、5%CO2及飽和濕度下，用含10%胎牛血清、2 ng/mL bFGF、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養基進行軟骨細胞培養、擴增，待細胞生長至70%～80%融合時進行傳代。

1.4 陰莖內核支架的打印

首先，CT掃描得到成年男性陰莖勃起狀態下的三維數據，應用三維打印技術，將PCL/HA（7∶3）打印成多孔道的人陰莖形態內核支架。

1.5 模具制備、表層細胞支架的塑形和復合支架組裝

以錫箔紙覆蓋打印完成的陰莖形態內核支架，用硅膠對內核支架的左右兩側分別印模（以正中矢狀面為界），得到的硅橡膠陰模灌鑄石膏陽模。參考文獻[16]的方法，將已塑形的左右兩部分PGA/PLA細胞支架嵌套在三維打印的陰莖內核支架左右兩側，在兩側細胞支架對合的縫隙處，滴加PLA溶液并施以適當壓力，擬合縫隙。

1.6 軟骨復合物的體外構建

取第1代乳豬關節軟骨細胞，以1×108cells/mL的濃度，接種于PGA/PLA-PLA/HA復合支架，5 h后，細胞與材料充分黏附，加入培養液體外培養，每2天換一次液。4周后，將構建物植入裸鼠背部皮下，在裸鼠體內培養8周。

1.7 大體及組織學觀察

8周后取材，觀察構建物顏色、質地，大體判斷是否為成熟軟骨，表層軟骨是否連續，形狀維持情況；將構建物沿正中矢狀面剖開，觀察軟骨厚度、是否均一，外部軟骨和內部多孔PLC/HA的界面整合情況。以4%多聚甲醛固定標本，30%蔗糖脫水，OCT包埋，冰凍切片（10 μm厚），HE染色，觀察組織結構及細胞外基質分泌情況。

2 結果

2.1 細胞形態觀察及PGA/PLA生物相容性評估

光鏡觀察發現，軟骨細胞形態呈長梭形、多角形，增殖快。圓柱形細胞支架直徑9 mm，厚1.5 mm。電鏡顯示，支架呈多孔結構，PLA增強了PGA之間的交聯，PGA/PLA顯示出很好的生物相容性，細胞黏附在PGA上，并且分泌基質覆蓋纖維（圖1）。

圖1 細胞形態觀察及材料生物相容性評估Fig.1Morphological observation of chondrocytes and evaluation of biocompatibility of PGA/PLA scaffold

2.2 莖模型的打印

PCL/HA混料均勻，三維打印的陰莖模型長3 cm，形態逼真，冠狀溝明顯，符合正常比例結構，材料內部為規則交叉的微小通道結構（圖2）。

圖2 計算機輔助設計及3D打印制作陰莖內核支架Fig.2Preparation of PCL/HA scaffold by CAD/CAM technique

2.3 PGA/PLA支架的制備及復合支架的組裝

陰模與陽模對合緊密，陽模石膏質地堅硬而陰模樹脂彈性好，兩者組合，利于對PGA材料加壓塑形。塑形完成的PGA細胞支架形態逼真，冠狀溝處尤其突出，質地如蛋殼，厚度1.5 mm。復合支架由外部的PGA/PLA細胞支架和內部的PCL/HA核構成。內、外兩部分匹配度高，嵌合緊密。完成的復合支架形態逼真。經過擬合，左右兩部分細胞支架結合為一體，僅留下一條淺淡的痕跡（圖3）。

圖3 復合支架的制備過程Fig.3Preparation of PCL/HA-PGA/PLA composite scaffold

2.4 組織工程構建軟骨的大體及組織學觀察

復合物在構建過程中，形態維持良好，體外培養4周后，表面形成一層不成熟的軟骨樣組織。植入裸鼠皮下后，無感染等發生，切口愈合好，皮膚無破損（圖4）。

圖4 軟骨體內構建Fig.4Reconstruction of cartilage in vivo

裸鼠體內培養8周后取材，大體為質硬、瓷白色軟骨樣組織，構建物表面光滑、連續，未見血管化。構建物的形狀和大小維持良好。縱切面觀察，發現PCL/HA核完全被軟骨包裹，相互交錯，緊密結合。HE染色顯示，陰莖假體外圍軟骨層與內核支架融合，有部分軟骨細胞及纖維結締組織長入支架內部，外圍軟骨細胞結構成熟并有軟骨陷窩形成，提示構建的陰莖軟骨復合體所形成的周圍軟骨組織完整，隨著時間的延長，可與內部支架緊密結合成為整體（圖5）。

圖5 體內8周組織大體觀及組織學情況Fig.5Gross view and histological observation of tissue harvested after implantation for 8 weeks

3 討論

組織工程軟骨是目前陰莖支撐體的主要研究方向，針對“中空”現象、力學強度不足、精確形態控制這三個再生陰莖軟骨支撐體的主要難題，本研究試圖通過三維打印和數字翻模技術制備復合支架，并應用組織工程技術再生軟骨，構建陰莖支撐體。

目前用于軟骨構建的主要材料有PGA、膠原、凝膠支架和Pluronics等。其中，凝膠支架、Pluronics、膠原的力學強度低，難以維持特定形態[17]；PGA組織相容性好、降解速率適中、細胞黏附性好、易塑形，在特殊形態軟骨構建中具有明顯優勢，PLA包埋PGA作為細胞支架現已應用于各種形態組織工程軟骨的構建[9-11]。但是，大體積軟骨的構建始終面臨著“中空”的問題[18]，這是由于構建物中心遠離表面，營養難以滲入，內部的酸性代謝產物也難以排出而蓄積，導致中心部分細胞活性變差乃至死亡，最終形成空洞，致使軟骨構建失敗。由于軟骨構建存在的厚度限制，單純以PGA/PLA為材料難以構建大體積軟骨。本研究在PCL/HA內核外層僅包被厚度為1.5 mm的PGA/PLA細胞支架，再生約1.5 mm厚度的軟骨，避免超過再生軟骨的厚度限制，從而避免了“中空”的問題。體內8周組織學結果顯示，PCL/HA內核外層再生出連續、均質、成熟的軟骨組織。

再造陰莖是否有足夠的強度以滿足性生活的需要，是衡量再造陰莖的一個重要指標，單純以PGA/ PLA為細胞支架構建的軟骨力學強度不足，難以滿足陰莖軟骨支撐體對強度的需求。本研究利用PCL良好的可塑性和較強的力學性能，通過三維打印技術，制備出具備精確人陰莖形態的PCL/HA內核，作為組織工程軟骨的內部支撐，其力學強度足以滿足陰莖支撐體的需求。陰莖支撐體的表層軟骨將PCL/ HA內核完全包裹，內核支架與機體之間形成有效隔離，避免了PCL/HA內核引起的免疫反應，同時有效減緩了PCL的降解速率，PCL/HA的長期留存可以保證陰莖支撐體強度的長期維持。

本研究通過對正常人陰莖進行激光輪廓掃描/磁共振斷層掃描，結合圖像三維重建技術，建立精確的人陰莖形態數字模型，并基于三維打印技術，制備出具有精確的人陰莖形態PCL/HA內核。應用數字翻模技術，在PCL/HA內核外層包被PGA/PLA細胞支架，組裝完成的復合支架仍可保持精確的人陰莖形態，解決了應用組織工程技術構建陰莖軟骨支撐體的形態控制問題。本研究結果顯示，三維復合支架、體外構建4周及裸鼠體內8周的軟骨支撐體，均具有陰莖頭、冠狀溝、陰莖體等陰莖正常解剖結構，實現了陰莖軟骨支撐體的形態控制。三維打印的內核表面具有規則的孔道結構，有利于外層軟骨組織與內核支架形成良好的嵌合，從而使陰莖支撐體成為完整的整體。本研究結果顯示，薄層的組織工程軟骨與內核嵌合緊密，融合成統一的整體，降低了外層軟骨組織與內核之間發生移位的可能性。

綜上所述，基于3D打印和數字翻模技術可成功制備出具備精確人陰莖形態的三維復合支架，結合組織工程技術可構建出內核為PCL/HA支架、外層包被成熟軟骨的人陰莖形態軟骨支撐體。

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Construction of Penis-Shaped Cartilage Using Tissue Engineering and 3D Printing Technologies

YUAN Zhaoyuan1, NING Jin1,CHEN Jie2,XIA Huitang2,TAO Ran2,ZHOU Guangdong1,2,3,XIAO Kaiyan2,CAO Yilin2,3．
1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College,Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery; Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China．Corresponding author:CAO Yilin(E-mail:yinlincao@yanhoo.com);XIAO Kaiyan(E-mail:xky7026@163.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of constructing a penis-shaped cartilage using tissue engineering and 3D printing technologies.MethodsA composite scaffold composed of PCL/HA and PGA/PLA were prepared for the reconstruction of penis-shaped cartilage by 3D printing.The penis-shaped PCL/HA scaffold prepared by 3D printing was beset between two separate PGA/PLA scaffolds that have a penis-shaped appearance.Articular chondrocytes were obtained from one-day-old roasters and then proliferated in order to meet the need of seeding sufficient cell into grafts.Cell-seeded constructs were cultivated in cartilage-inducing media for 4 weeks and then implanted under the dorsum skin of athymic nude mice.After 8 weeks'cultivation in vivo,constructs were harvested and grossly observed.Then the specimens were sagittally dissected to observe the interface between the regenerated cartilage and the porous PCL/HA scaffold and histology of engineered cartilage was examined in vivo.ResultsPenis-shaped models made of PCL/HA were printed into an exact penis shape and then composite scaffolds were assembled into a verisimilar penis.In the process of reconstruction,the initial shape of cell-seeded constructs were generally maintained.The surface of the specimens was smooth and continuous and no vascularization was observed.In cross section,the PCL/HA core were completely surrounded by the homogeneous neocartilage and the two phase interlocked well with each other.ConclusionIt is feasible to construct a penis-shaped cartilage with the PCL/HA core surrounded by the homogeneous neocartilage by using tissue engineering and 3D printing technologies.

Tissue engineering;3D-printing;Composite scaffold;Penis cartilage

Q813.1+3

A

1673－0364（2017）03－0123－05

2017年3月19日；

2017年4月29日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.03.002

上海市衛生局項目（課題編號：20134323）。

261042山東省濰坊市濰坊醫學院整形外科研究所（袁兆遠，寧進，周廣東）；200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室（陳潔，夏會堂，陶然，周廣東，肖開顏，曹誼林）；200241上海市組織工程國家工程研究中心（周廣東，曹誼林）。

曹誼林（E-mail：yinlincao@yanhoo.com）；肖開顏（E-mail：xky7026@163.com）。