不同地理居群冰清絹蝶翅脈的幾何形態學分析

郝祥瑜 毛增輝 任華

摘要 [目的]研究幾何形態學方法在研究蝶類昆蟲種內居群間分化的可行性和有效性。[方法]以冰清絹蝶為研究對象，對我國冰清絹蝶主要地理分布區的10個地理居群共200個體翅脈脈相的相關指標進行研究，利用三維數碼顯微鏡共測量、分析前后翅共計17種脈相的幾何形態學性狀（包括翅脈長度、翅脈兩點間線段長度、中室面積等），再利用SPSS 21.0軟件對篩選出的有效性狀進行了統計和聚類分析。[結果]冰清絹蝶10個地理居群的形態分化和它們的地理分布之間存在明顯的相關性；安徽滁州瑯琊山的居群在聚類樹上的位置較為特殊，沒能顯示出與其地理分布間的明顯關聯性。[結論]幾何形態學分析方法在蝶類的種內分化研究中是一種十分有效的輔助手段。

關鍵詞 冰清絹蝶；地理居群；翅脈特征；幾何形態學；系統分類

中圖分類號 Q964 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0084-05

Abstract [Objective] The aim is to investigate the feasibility and validity of the method of geometric morphology in the study of the differentiation among populations of butterflies. [Method]With Parnassius glacialis as study object， related index of 200 individual venation in 10 geographic populations in major geographic regions were studied.Geometric morphological characters （including length of the venation，length of the line between two venation，area of the discal cell，etc.） of a total of 17 kinds of venation of forewings and hindwings were analyzed through threedimensional digital microscope，and then SPSS 21.0 software was used to carry out statistical analysis and cluster analysis on the selected effective characters. [Result] There was a significant correlation between morphological differentiation and geographical distribution of the 10 geographic populations of the Parnassius glacialis；since the location of the cluster in the clustering tree on Langya Mountain in Chuzhou Anhui was special，thus there was not a clear correlation between the geographical distribution. [Conclusion]Method of geometric morphology analysis is a very effective auxiliary means in the study of intraspecific differentiation of butterflies.

Key words Parnassius glacialis；Geographic population；Vein characteristics；Geometric morphology；Systematic classification

在傳統昆蟲分類學中，昆蟲的翅脈特征（脈相）是一個非常重要的分類學指標。翅脈特征不僅對昆蟲的分類鑒定有重要意義，還可以應用于對昆蟲的物種多樣性、系統發生發育及昆蟲在不良環境條件下所發生的變異程度的研究[1]。

幾何形態學（Geometric morphometrics）是關于形態定量比較的科學計算工具，是用數學方法描述或分析一個圖像形狀結構的方法。其研究方法多種多樣，但在技術路線上都需要先將形態數據數字化，再比對不同的樣本。通過比對可以計算出樣本之間的形狀和大小差距。這里的比對作用類似分子系統學研究中分子序列比對，意在找到樣本之間的“同源信號”和“簡約信息位點”。通過比對篩選出有效生物學性狀，再用統計學的方法統計聚類。在國外，幾何形態學方法已廣泛應用于探討生物的個體發育、種群分化、系統進化等多個方面，研究對象以大動物居多。在國內，僅用于昆蟲的分類鑒定及遠程自動識別研究中。目前，國內隨著計算機圖像處理技術的不斷發展，以昆蟲翅脈特征提取為核心技術的軟件也日趨完善，圖像數字化處理技術與傳統昆蟲形態學結合已經充分應用到昆蟲種間的分類鑒定中[1-5]，但是運用幾何形態學方法研究蝶類昆蟲種內居群間分化國內外鮮有報道。

絹蝶屬（Parnassius）是絹蝶亞科（Parnassidae）絹蝶族中的一個屬，物種繁多，廣泛分布于古北界及新北界溫帶的高山地區，從巴基斯坦到中亞和中國，部分物種擴至到歐洲、日本及北美洲，因物種分布廣，各地理因素如山脈、海洋、河流等導致物種隔離，繼而演化出許多亞種[6]。我國絹蝶資源豐富，據周堯《中國蝶類志》記載：全世界絹蝶有38種，僅我國就有35種124亞種。主要產于高山上，耐寒力強，僅少數種類分布在低海拔，寄主植物是景天科及紫堇、延胡索等。冰清絹蝶（Parnassius glacialis Butler）是分布在低海拔地區的絹蝶，也是我國江南分布的唯一一種絹蝶，這可能是第四紀冰期的遺留物[7]，主要分布在河南、山東、陜西、湖北、安徽、浙江、江蘇、甘肅等地。寄主植物單一（寡食性），主食罌粟科紫堇屬（Corydalis edulis Maxim）的延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）和小藥八旦子（Corydalis caudata）[6，8-9]。其形態學特征：體黑色，披有黃色長毛，頸部有1輪黃色毛叢。翅色白而稍呈蠟黃，翅質薄而半透明，溫潤如絲絹，翅脈灰黑褐色。前翅亞外緣有1條褐色帶紋。中室內和中室端各有1個黑褐色斑紋；后翅內緣的黑帶較寬，上披黃色長毛（圖1）[7，10]。

生物地理學是生物學和地理學間的邊緣學科，主要研究生物在時間和空間上的分布，并嘗試分析和解釋物種的地理分布為何呈現如今所見的格局。該研究嘗試通過對不同地理居群冰清絹蝶翅脈特征的幾何形態學計量，推測冰清絹蝶現有分布格局的形成機制，旨為相關領域研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取冰清絹蝶10個地理居群的標本（每一居群隨機抽樣20個體），涵括了冰清絹蝶的大部分分布區，具體的采樣點信息如表1所示。野外采集的蝶類標本立即投入無水乙醇中（無錫市展望化工試劑有限公司）保存，所取標本均來源于安徽師范大學生命科學學院分子系統學與進化研究室（-80 ℃）樣品庫內。

1.2 標本處理

取出浸泡在無水乙醇中的蝴蝶，用鑷子夾取蝴蝶翅膀的基部，使其完整地脫落，待乙醇揮發完全，在蝶翅下方置墊一小方塊白紙，便于與黑色翅脈形成反差；其上蓋上一載玻片，將蝶翅壓平，放入基恩士VHX-5000三維數碼顯微鏡（日本）中觀察測量（分辨率2400DPI）。

1.3 圖像獲取 利用基恩士VHX-5000三維數碼顯微鏡的圖像拼接技術對圖像進行采集，形成一張完整的蝴蝶全翅圖片，在該數碼顯微鏡的測量工具中，利用鼠標多點連線或兩點間連線描摹出翅脈的紋路并且勾勒出所需測量的翅脈長度和面積，即可進行測量。前翅共測得13組數據，后翅共測得4組數據（精度為1 μm或1 μm2），保存拍攝圖片以及測量結果生成擴展名為.csv的文件，利用VHX Measurement Data Tabulation Tool軟件將數據導出至Excel表格中。

1.4 數據分析

在Excel表格中，整理和統計10個居群共200個絹蝶所測得的翅脈長度和面積，并求出均值，對翅脈長度、蝶翅中室面積、全翅面積等性狀進行統計分析，利用SPSS 21.0軟件分別對各組數據進行初步系統聚類，篩選出聚類結果相同的一些性狀，舍棄部分不適合聚類分析的性狀，最后對篩選出的性狀進行統計和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 10個冰清絹蝶地理居群的翅脈形態學特征平均值

分別取10個地理居群各20個體冰清絹蝶，測量前翅11組長度數據、2組面積數據；測量后翅2組長度數據、2組面積數據（圖2）。求得前后翅翅脈形態學特征平均值（表2、表3），表2為前翅翅脈數據，表3為后翅翅脈數據。根據Excel文檔求出P值結果小于0.05，表示各特征值的不同均由不同居群的冰清絹蝶的形態差異引起。

從表2可以看出，南京、連云港、天堂寨、天目山的冰清絹蝶蝶翅面積較大，各翅脈長度相對較長。利用SPSS 21.0對前后翅共計17組數據進行聚類分析，并一一比對，選出聚類分析較為相似的數據共10組，即為有效性狀。

2.2 10個冰清絹蝶地理居群的聚類分析樹狀圖

利用SPSS 21.0再將10組有效性狀（前翅分別為ab、R1、R5、M1、Cu2、2A、af、中室面積；后翅分別為ab、中室面積）進行聚類分析，繪制出樹狀圖，從樹狀圖得出結論：冰清絹蝶的演化劃分為兩支，共聚為兩大類，一類分為天堂寨、天目山、南京、連云港4個地理居群，另一類分為泰山、嵩山、瑯琊山、天水、黃柏塬、神農架6個地理居群。即天堂寨、天目山、南京、連云港這4個地理居群的冰清絹蝶親緣關系較近，而泰山、嵩山、瑯琊山、天水、黃柏塬、神農架6個地理居群的冰清絹蝶親緣關系較近（圖3）。

2.3 冰清絹蝶演化路徑推測圖

根據聚類樹狀圖繪制成冰清絹蝶演化路徑的推測圖（圖4）。地質學資料顯示，大約6 000萬年以前，印度板塊和亞歐板塊碰撞導致的造山運動逐漸形成了青藏高原，包括喜馬拉雅山脈[11]。同時，相關的分子系統學和分子鐘研究推測，距今2 000萬～3 000萬年前，絹蝶屬物種的祖先在我國西南地區（現今藏東南的橫斷山脈一帶）開始形成[8]，其時，它們已產生了一些適應高海拔環境的特性，如翅膀被毛、耐寒冷、耐低氧等等，隨著絹蝶屬的分化和物種之間的競爭，以及中新世以后，特別是第四紀期間全球氣候變化的影響，冰清絹蝶開始向華中、華北、華東地區遷移，形成2支演化路徑：第一支由喜馬拉雅山脈經過唐古拉山、巴顏喀拉山，到達位于秦嶺的天水、黃柏塬一帶，再分為三小支，途經華北平原分別向泰山、嵩山、瑯琊山3個方向遷移；第二支由喜馬拉雅山脈發源，向東遷移經過秦嶺、四川盆地到達天堂寨、南京、天目山等地，最后沿海岸線擴散至連云港一帶。成為我國唯一一種分布到長江以南，生活在較低海拔地區的絹蝶，且對生活環境的要求極為苛刻[7，12-13]。

3 結論與討論

安徽天堂寨位于大別山區，是南北水系的分水嶺，屬大別山系，地質基礎為前震旦紀的秦嶺褶皺帶，后期受燕山期造山運動的顯著影響；浙江天目山和江蘇南京紫金山總體上屬于寧鎮山脈，是侏羅紀末至白堊紀初期，通過寧鎮山脈造山運動形成的一條向北突出的弧形皺；江蘇連云港云臺山的地質基礎則屬于華北古陸構架。這些古地質事件形成的山脈后來都經過頻繁的地質變化過程，最終形成了現在的地質地貌。

甘肅天水屬小隴山系，為秦嶺的西北緣；陜西黃柏塬地為秦嶺腹地；湖北神農架屬大巴山系，河南嵩山屬伏牛山系，它們都是秦嶺造山帶的余脈；山東泰山構造基礎為古華北地帶，后來經漫長而又復雜的演化過程才形成今天的地貌；安徽瑯琊山為江淮之間的低山丘陵地帶，系大別山系向東延伸而成的余脈。

總體而言，上述地質過程，包括較晚近的燕山運動時期（在地史上主要屬于侏羅紀末到古近紀初這段時期，距今2億1千萬年左右開始至6 500萬年前為止）相對于絹蝶種群的分化時期而言（據分子鐘推測為350萬前至30萬年前），是一個十分古老的時期，因而，這些地質因素對冰清絹蝶的擴散無關。

綜合多方面證據分析，筆者推測，冰清絹蝶不同居群間的擴散路徑與其地理分布（相關山脈分布、走向及地理隔離等）之間有明顯的相關性，即地質歷史上，第四紀開始至今的地質、生物環境和氣候變化因素對冰清絹蝶的擴散路徑和現代地理分布產生了重要影響[8，11]。譬如，第一進化支（天堂寨、天目山、南京、連云港4個地理居群）各居群的生態環境極為相似，均位于華北平原與長江中下游平原地帶，海拔較低，降水豐富，屬于亞熱帶季風氣候與溫帶季風氣候交界處；而第二進化支（黃柏塬、神農架、天水、嵩山、泰山5個地理居群）的生態環境類似，海拔相對較高，氣溫也相對較低，地處內陸，降水相對較少。至于安徽瑯琊山的居群，單從地理因素考慮，理論上應屬于第一進化支，從而支持安徽師范大學生命科學學院分子系統學與進化研究室利用分子手段分析的結果。但從形態上看，瑯琊山居群確實很特殊（如后翅基部較大范圍明顯的黑色斑塊，體毛為灰白色），且和嵩山或泰山等高緯度地區的居群極為相似。推測這有可能受其寄主植物及采蝶時（2013年4月29日）當年的氣候影響，因為不同氣候（如陰雨、干旱、季節變化等）、寄主植物均影響蝶類個體發生和發育[12，14-17]。

研究冰清絹蝶寄主植物和氣象的相關資料，結果表明，延胡索是瑯琊山冰清絹蝶的唯一寄主植物，且大都分布在瑯琊山寺附近高海拔地區（海拔200～300 m），蝶類對寄主植物專一性較強，雖然它們有一定的遷飛能力，但其分布仍然以寄主為中心[12-13，18-19]。據文獻記載，延胡索瑯琊山居群的6種主要異喹啉生物堿含量在河南、安徽、浙江、江蘇、江西等12個居群中大都高于其他居群，尤其是紫堇堿含量最高（0.44%），比含量最低的江西宜興大灘嶺居群（0.024%）高達近20倍，又因延胡索對環境要求很嚴，對于低洼易積水及水分較少的干旱地段均不適合延胡索的生長，其生長期僅有3個月，一般分布在海拔200～800 m的丘陵山區的半陰坡，系早春植物[20]；同時，安徽滁州氣象站提供氣象資料和中央氣象局數據庫數據顯示，瑯琊山地區2013年3、4月降水量均為18.4 mm，與近30年同期均值相比，偏少7成；日照均為240 h，與常年相比偏多4成，整體氣候近為春旱，冰清絹蝶與其寄主植物休戚相關。所以，瑯琊山居群獨特的翅脈形態特征可能與其寄主植物和當地的氣候條件等都有密切關系。

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