具有潛在抑制腸道致病菌能力的乳酸菌的篩選

陳大衛(wèi) 劉莎莎 黃玉軍

摘要 [目的]從實驗室保藏的乳酸菌中篩選出耐酸耐膽鹽能力較強的乳酸菌，并研究其對腸上皮細胞的黏附能力及對腸道病原菌的抑制能力。[方法]通過模擬人工胃腸液及體外與IEC-6細胞共培養(yǎng)來分別研究乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力及對細胞的黏附能力，并利用單層瓊脂平板擴散法測定其抑菌效果。[結(jié)果]試驗的27株乳酸菌中，10株乳酸菌在pH 3.0的人工模擬胃液中培養(yǎng)3 h的存活率均大于44.00%，在pH 8.0的人工模擬腸液中培養(yǎng)4 h的存活率均大于51.56%，在含0.30%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的存活率均大20.00%；其中菌株C13、A03、A17及A90對IEC-6細胞的黏附個數(shù)均大于8個/cell；菌株C13、A03對艱難梭菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑制能力較強，抑菌圈直徑均大于22 mm。經(jīng)16S rRNA測序?qū)13 和A03分別鑒定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosu）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。[結(jié)論] L.rhamnosu C13、L.plantarum A03的耐酸耐膽鹽能力及對上皮細胞的黏附能力較強，對腸道病原菌有較好的抑制作用，可作為良好的抑制腸道病原菌的候選益生菌株。

關(guān)鍵詞 乳酸菌；耐酸耐膽鹽；黏附；抑菌

中圖分類號 TS252.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0078-03

Abstract [Objective] Lactic acid bacteria （LAB） with strong resistance of acid and bile salt were screened from laboratory，and their adhesion ability of intestinal epithelial cells and inhibition ability to intestinal pathogens were studied.[Method]The resistance of acid and bile salt and the adhesion ability of IEC6 cells were studied by artificial gastrointestinal fluid and cocultured with IEC6 cells，respectively，and the bacteriostatic effect was deter mined by single agar plate diffusion method.[Result]The survival rate of 10 strains were cultured 3 h in pH 3.0 artificial gastric juice was greater than 44.00%，and cultured 4h in pH 8.0 artificial intestinal juice was greater than 51.56%，and cultured 24 h in medium containing 0.30% bile salts was greater than 20.00%； the adhesion number of C13，A03，A17 and A90 on IEC6 cells was greater than 8 cells； the inhibiting capacity of C13，A03 on Clostridium difficile，Salmonella and Escherichia coli was stronger than others，the antibacterial circle diameter was greater than 22 mm.C13 and A03 were identified as Lactobacillus rhamnosu and Lactobacillus plantarum by 16S rRNA sequencing，respectively.[Conclusion]L.rhamnosu C13，L.plantarum A03 with the strong ability of acid and bile salt resistance and adhesion to epithelial cells，which have good inhibitory effect on pathogenic bacteria，and can be used as a fit probiotic candidate strain.

Key words Lactic acid bacteria； Resistance of acid and bile salt； Adhesion； Inhibition of pathogenic bacteria

腸道菌群在維持機體的健康過程中發(fā)揮著重要的作用，與人體的消化營養(yǎng)、免疫代謝、生物拮抗等密切相關(guān)[1]。抗生素由于見效快、針對性強等特點被大量用于疾病的治療，而其過度使用導(dǎo)致了腸道菌群的紊亂，引起了艱難梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌等腸道致病菌的繁殖，進而引發(fā)機體腹瀉、嘔吐、酸中毒等癥狀，同時也會導(dǎo)致機體易感染情況增加，引起二重感染，降低其免疫功能，對機體的健康產(chǎn)生了嚴重的影響[2-3]。

乳酸菌作為人體腸道中的重要有益微生物，可以通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸、乳酸、甲酸、細菌素、過氧化氫及小分子肽類等一系列代謝產(chǎn)物來拮抗腸道致病菌[4]；同時乳酸菌通過其表面的黏附素與腸黏膜細胞緊密結(jié)合，形成生理屏障，并通過與致病菌競爭腸道上皮細胞的黏附位點、生存空間及營養(yǎng)物質(zhì)來抑制腸道病原菌的生長[5]，改善腸道菌群紊亂的狀況，達到改善腸道微環(huán)境的效果。乳酸菌作為益生菌必須對腸道的酸和膽鹽等不良環(huán)境有一定的耐受性，同時能夠黏附在腸上皮細胞上才能發(fā)揮其益生功能[6]。筆者從實驗室保藏的乳酸菌中篩選出耐酸耐膽鹽能力及黏附能力較強的乳酸菌，研究其對腸道病原菌的抑制能力，為其進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與主要試劑。

試驗菌株，江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室提供。膽鹽，美國Difco公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，上海生工生物工程公司；DNA提取試劑盒，上海生工生物工程公司；艱難梭菌、大腸桿菌、沙門氏菌，中國微生物菌株保藏中心；IEC-6細胞，上海麥莎生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基，美國Invitrogen公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；強化梭菌培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；抗生素藥敏試紙，杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。JF-SX-500全自動滅菌鍋，日本TOMY公司；Thermo Scientific 1300生物安全柜、Legendmach1.6R高速冷凍離心機，美國塞默飛世爾科技有限公司；OlympusCX41生物顯微鏡，日本Olympus公司；UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；PCR擴增儀，美國ABI公司；Infinity3026凝膠成像系統(tǒng)，法國Vilber Lourmat公司。

1.1.3 主要試劑的配制。

模擬胃液：0.3%的胃蛋白酶溶于PBS溶液，1 mol/L HCl調(diào)pH至3.0，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

模擬腸液：0.1%的胰蛋白酶溶于PBS溶液，0.4% NaOH溶液調(diào)pH至8.0，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌[7]，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)處理。

將活化后的乳酸菌按3%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，10 500 r/min離心10 min收集菌體，用滅菌的PBS溶液將菌體洗滌后懸浮，并調(diào)整其OD560nm為1.0，4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 IEC-6細胞的培養(yǎng)。

將IEC-6細胞置于DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)液，當細胞增殖融合率達80%時，用0.25%的胰酶（0.02%EDTA）消化細胞，傳代5次后進行下一步試驗。

1.2.3 致病菌的培養(yǎng)與處理。

將沙門氏菌、大腸桿菌以3%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，艱難梭菌以3%的接種量接種到RCM培養(yǎng)基中，活化3代，37 ℃培養(yǎng)24 h，利用平板計數(shù)法測定其活菌數(shù)，用滅菌的培養(yǎng)基調(diào)整其活菌數(shù)為107 CFU/mL，4 ℃冷藏備用。

1.2.4 乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力。分別取1.0 mL的乳酸菌菌懸液于9.0 mL的模擬胃液和9.0 mL的模擬腸液中，于37 ℃分別培養(yǎng)3 h和4 h后測定其活菌數(shù)，按公式（1）、（2）計算其存活率。將乳酸菌菌懸液按3%的接種量接種于含0.30%膽鹽及不含膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h測定其OD600nm值，按公式（3）計算其存活率。

存活率=3 h的活菌數(shù)/0 h的活菌數(shù)×100% （1）

存活率=4 h的活菌數(shù)/0 h的活菌數(shù)×100% （2）

存活率=含膽鹽培養(yǎng)基的OD值/不含膽鹽培養(yǎng)基的OD值×100% （3）

1.2.5 乳酸菌的黏附能力。

調(diào)整IEC-6細胞的濃度為2×104 cells/mL，接種于培養(yǎng)板中，預(yù)先置入22 mm×22 mm無菌蓋玻片，使細胞貼附蓋玻片生長，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用PBS沖洗并調(diào)整培養(yǎng)后的乳酸菌，使其菌體濃度為1×108 CFU/mL。待細胞長成致密單層后，用PBS緩沖液漂洗細胞2次，然后每孔加入不含抗生素的1 mL DMEM培養(yǎng)液和1 mL上述制備好的乳酸菌菌懸液，輕輕搖晃混勻，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，每株菌重復(fù)3孔。

培養(yǎng)60 min后，用PBS緩沖液洗滌細胞5次，除去未黏附的乳酸菌，然后加入無水甲醇固定20 min，對細胞進行革蘭氏染色，顯微鏡下隨機選取20個視野，計算100個細胞上黏附的乳酸菌個數(shù)，以平均每個細胞所黏附的乳酸菌個數(shù)表示黏附能力[8]。

1.2.6 乳酸菌的抑菌能力。

采用單層瓊脂平板擴散法[9]，將固體LB培養(yǎng)基溶化后倒入平板中，待冷凝后，取菌液濃度為108 CFU/mL的0.20 mL致病菌菌液加入培養(yǎng)基平板上，用無菌涂抹棒在超凈工作臺內(nèi)將致病菌菌液涂抹均勻，待菌液固定在培養(yǎng)基表面后打孔，將活化好的乳酸菌發(fā)酵菌液注入孔內(nèi)至滿孔，于37 ℃培養(yǎng)10 h，測量抑菌圈直徑，該試驗需重復(fù)3次。判定標準（含打孔器直徑）：無抑菌圈為不抑菌，10～15 mm為低度抑菌，15～20 mm為中度抑菌，大于20 mm為高度抑菌。

1.2.7 乳酸菌的鑒定。

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA，參考文獻[10]的方法進行16S rDNA-PCR擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，將測序結(jié)果通過BLAST程序與GenBank基因庫進行在線比對以得出結(jié)果。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理。采用SPSS 20.0、Origin軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對胃腸液的耐受性

由表1可知，不同乳酸菌的耐酸能力不同，其中菌株C13、A17、A90、A04、A03、T70、R07、Z05、A70、R04、R23及A90在pH 3.0的人工模擬胃液中培養(yǎng)3 h存活率均大于44.00%，顯著高于其他菌株（P<0.05），而在模擬人工腸液中培養(yǎng)4 h的存活率均大于51.56%，也顯著高于其他菌株（P<0.05）。有17株乳酸菌在人工胃液和腸液中的存活率均高于20.00%，選取這17株乳酸菌進行下一步試驗。