不同加工方式對EGCG抑制金黃色葡萄球菌活性作用的影響

蔡天舒 李瑋瑋 梁婷

摘要 [目的]研究經不同加工處理后表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響，從而為EGCG在食品生產加工中的抑菌應用提供依據。[方法]利用3種不同加工方式對EGCG進行處理，采用最低抑菌濃度測定法（MIC法）與紙片瓊脂擴散法（KB法）檢測EGCG的抑菌效果，利用BairdParker平板計數法檢測EGCG對牛奶中金黃色葡萄球菌的抑制效果。[結果]EGCG抑菌能力隨著濃度的增高而提升。相同濃度下，EGCG經過不同加工方式后抑菌能力大小依次為巴氏殺菌法（72 ℃，20 s）>高壓蒸汽滅菌法（121 ℃，15 min）>薄膜過濾法（0.22 μm），最低殺菌濃度（MBC）依次為0.062 5 、0.125 0和1.000 0 mg/mL，經巴氏殺菌法處理的EGCG抑菌效果最強。而EGCG在牛奶中的抑菌作用不顯著。[結論]在多種食品加工條件下，EGCG對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性。

關鍵詞 表沒食子兒茶素沒食子酸酯；金黃色葡萄球菌；食品加工；牛奶

中圖分類號 TS201.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0066-03

Abstract [Objective]To research and find the best treatment mode of Epigallocatechin gallate （EGCG） against Antibacterial Action of Staphylococcus Aureus， which will provide a reference for application of EGCG in food production and processing. [Method]The EGCG were processed in three different ways. Minimal Inhibitory Concentrations（MIC） and KirbyBauer testing measured the antibacterial effect of EGCG. The antibacterial effect of EGCG against S.aureus in milk was measured by the BairdParker Plate Count Method. [Result]The antibacterial capability of EGCG increased with increasing concentration. The antibacterial capacity of EGCG against S.aureus in three different treatments were ordered as Pasteurization （72 ℃， 20 s）>High Pressure Steam Sterilization （121 ℃， 15 min） >Filtration （0.22 μm）， and the minimum bactericidal concentration （MBC） were ordered as 0.062 5 ， 0.125 0 and 1.000 0 mg/mL respectively. It coud be concluded that EGCG treated by pasteurization has the strongest antibacterial activity against S.aureus. However， effect of EGCG against S.aureus in milk was unremarkable. [Conclusion]Under various food processing conditions， EGCG has strong antibacterial capability against S.aureus.

Key words Epigallocatechin gallate （EGCG）； Staphylococcus aureus；Food processing；Milk

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛分布于自然界中，是最常見的食源性致病菌之一，由腸毒素引發細菌性食物中毒，與食品加工和醫藥衛生領域的安全息息相關[1]。在我國，由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒事件逐年上升，其在乳制品、生鮮牛奶、生肉和水產品等多種食品中均有較高的檢出率，由此引發的食品安全問題已成為重點研究課題[2-3]。目前主要利用化學防腐劑如山梨酸、苯甲酸等通過破壞細胞結構來抑制食品中微生物生長，延長貯藏時間和保持品質[4]。同時，天然植物型防腐劑的研究和應用越來越廣泛，食用安全性和廣譜抗菌能力得到了充分的證實[5]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是茶葉中多酚類物質的重要活性成分之一，作為一種天然提取物，具有活性強、毒副作用低、安全性良好的特點[6-7]。研究表明，EGCG具有很強的抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、保護神經系統、抑菌和抑制細菌毒力的性能[8]。EGCG具有廣譜抑菌能力，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌等均具有良好的抑制作用[9-10]。目前，針對EGCG作為食品防腐劑，在不同加工方式下對其抑菌活性作用的影響，以及EGCG在牛奶中抑菌效果的研究鮮有報道。因此，筆者以金黃色葡萄球菌為研究對象，采用高壓蒸汽滅菌法、薄膜過濾法、巴氏殺菌法3種最為主要的食品加工方式對EGCG進行處理，研究不同處理方式對EGCG抑菌活性的影響，旨在為EGCG在食品加工中的抑菌應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC29213）。

1.1.2 培養基。MuellerHinton肉湯、MuellerHinton瓊脂、BirdParker培養基，均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 試劑和耗材。EGCG（E4143，Sigma），牛奶（市售超高溫滅菌乳），Φ 6 mm無菌空白藥敏紙片（OXOID），96孔板（Thermo），0.22 μm針頭式過濾器（Millipore）。

1.1.4 儀器與設備。酶標儀（邁瑞），微生物培養箱（賓得），麥氏比濁儀（梅里埃），高壓蒸汽滅菌鍋（博迅）。

1.2 方法

1.2.1 EGCG溶液的配制。分別采用高壓蒸汽滅菌法（121 ℃，15 min）、薄膜過濾法（0.22 μm針頭式過濾器對所配制的EGCG溶液進行過濾處理）、巴氏殺菌法（72 ℃，20 s）3種方式對2 mg/mL的EGCG溶液進行無菌處理，然后使用MH肉湯培養基進行梯度稀釋，使其終濃度依次為2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 7、0.007 8、0.003 9 mg/mL。為保證EGCG溶液質量，采取現配現用的方式。

1.2.2 菌液的制備。

將培養至對數期的金黃色葡萄球菌ATCC29213菌懸液，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，菌體沉淀用生理鹽水復溶，并將菌懸液調至0.5麥氏濁度，此時菌懸液濃度約1.0×108 CFU/mL。

1.2.3 EGCG對金黃色葡萄球菌抑菌能力的測定。

按照“1.2.1”與“1.2.2”方法制備EGCG溶液與菌懸液，其中菌懸液以1∶10倍稀釋獲得1.0×107 CFU/mL。利用最低抑菌濃度測定法（MIC），采用96孔板，每孔分別對應加入190 μL的10種不同濃度的EGCG溶液和MH肉湯培養基，同時每孔內加入稀釋后的菌液10 μL，使菌液終濃度至5×105 CFU/孔。另設置不同濃度的EGCG溶液和MH肉湯培養基作空白對照，置于37 ℃孵育24 h后，利用酶標儀在波長600 nm下測定吸光度值。

1.2.4 EGCG對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的測量。

采用紙片瓊脂擴散法（KB法）觀察不同處理方式下EGCG對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。按照“1.2.1”方法配制10種不同濃度EGCG溶液。將無菌藥敏紙片置于上述10種濃度EGCG溶液中充分浸泡12 h，備用。MH肉湯培養基作為陰性對照。用無菌棉簽將濃度為0.5麥氏濃度的菌懸液均勻涂布接種于MH瓊脂平板，涂布3次，每次平板旋轉60°，最后沿平板內沿涂抹一周，室溫干燥3～5 min，用無菌鑷子取藥敏紙片，貼于含菌瓊脂表面。將以上平板37 ℃倒置培養24 h，用游標卡尺測量EGCG抑菌圈直徑。

1.2.5 EGCG在牛奶中的抑菌檢測。

將50和25 mg EGCG粉末分別加入99 mL牛奶中，使其終濃度分別為0.50和0.25 mg/mL，并進行巴氏消毒處理。同時將1 mL金黃色葡萄球菌液（1.0×107 CFU/mL）加入牛乳中充分混勻，菌液終濃度為1.0×105 CFU/mL。 對照組僅將1 mL菌液加入99 mL牛奶中，不添加EGCG粉末，充分混勻。將上述試驗組和對照組牛奶于37 ℃靜置培養，并分別于0、2、4、6、8、 10、12 h取出培養物，按照GB 4789.10—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》中的第二法BairdParker平板計數法檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的數量，從而測定EGCG在牛奶中的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 EGCG對金黃色葡萄球菌的抑菌能力 最低殺菌濃度（MBC）指抗菌藥物完全殺滅細菌所需要的最低濃度，是衡量藥物抗菌活性大小的重要指標[11]。該研究利用不同加工方式處理EGCG后，其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果如表1所示。通過對比研究表明，隨著EGCG濃度的增加，其抑菌效果逐步增強；巴氏殺菌法、高壓蒸汽滅菌法和薄膜過濾法MBC分別為0.062 5、0.125 0和1.000 0 mg/mL；當EGCG濃度為0.062 5 mg/mL時，巴氏殺菌法抑菌率為100%，而高壓蒸汽滅菌法為59%，薄膜過濾法僅為45%；當采用EGCG最低檢測濃度0.003 9 mg/mL時，巴氏殺菌法處理后EGCG抑菌能力降至21%，高壓蒸汽滅菌法為18%，薄膜過濾法僅為4%。由以上結果可看出，經過巴氏殺菌法處理的EGCG對金黃色葡萄球菌抑菌活性優于高壓蒸汽滅菌法和薄膜過濾法。

2.2 EGCG對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的測量

采用紙片瓊脂擴散法（KB法）進一步測定不同加工處理方式對EGCG抑制金黃色葡萄球菌的能力。結果顯示（表2），巴氏殺菌法>高壓蒸汽滅菌法>薄膜過濾法。其中巴氏殺菌法（72 ℃，20 s）作用下的EGCG抑菌效果最好，其濃度為2.000 0、1.000 0、0.500 0和0.250 0 mg/mL時，均可見明顯的透明抑菌圈，表現出顯著的抑菌能力，此后隨著EGCG濃度的降低，其抑菌活性也隨之下降，當濃度降至0.031 3 mg/mL時，抑菌圈完全消失。EGCG經過高壓蒸汽滅菌法和薄膜過濾法處理后，抑菌圈分別在濃度為0.062 5和0.125 0 mg/mL時完全消失。

2.3 EGCG在牛奶中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果 根據上述不同處理方式對EGCG抑菌能力影響的結果，選擇巴氏殺菌法檢測EGCG在牛奶中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。由于EGCG在濃度0.500 0和0.250 0 mg/mL時對金黃色葡萄球菌的抑制率均達100%，且具有明顯抑菌圈，故選擇這2個濃度條件下研究EGCG在牛奶中的抑菌效果。研究結果顯示（圖1），當金黃色葡萄球菌初始濃度為105 CFU/mL時，隨著培養時間的延長，對照組與試驗組中金黃色葡萄球菌數量均呈現上升趨勢，至12 h時，對照組中金黃色葡萄球菌的數量達到109 CFU/mL，而分別加入0.500 0與0.250 0 mg/mL的EGCG試驗組牛奶中的菌落數分別為6.3×108和6.5×108 CFU/mL。雖然試驗組菌落數相比對照組略有降低，但無顯著性差異。由此可見，EGCG在牛奶中對金黃色葡萄球菌無顯著抑制效果。

3 結論與討論

金黃色葡萄球菌污染食品后導致其腐敗變質，并產生腸毒素引起食源性中毒和胃腸炎癥，是引起細菌性食物中毒的主要原因之一[12]。當食物中金黃色葡萄球菌濃度為105～106 CFU/g時，即可產生足夠濃度的腸毒素進而使易感人群出現中毒癥狀[13]。EGCG作為食品抗氧化劑茶多酚的主要生物活性成分之一，其抗氧化能力和清除自由基能力最強，同時對促進人體健康有積極作用，如抑制細菌生長、調節血脂、抵抗腫瘤、抑制肥胖等[14]。

為探究EGCG作為食品添加劑在多種食品加工和無菌處理環節中的生物活性，該研究以金黃色葡萄球菌為目標菌，EGCG經高壓蒸汽滅菌、巴氏殺菌和薄膜過濾處理后，均具有較強的抑菌效果與殺菌能力。不同處理方式對EGCG活性具有一定的影響，其抑菌能力由大到小依次為巴氏殺菌>高壓蒸汽滅菌>薄膜過濾法。其中巴氏殺菌法處理方式下的EGCG抑菌活性效果最強，其MBC為0.062 5 mg/mL，當采用最低EGCG濃度（0.003 9 mg/mL）時，其抑菌率仍為21%。EGCG常溫下在水溶液中的溶解性較差，巴氏殺菌法通過72 ℃加熱20 s，適當的短時高溫使難溶性于水的EGCG在培養基中的溶解能力增強，抑菌能力提升。EGCG經過高壓蒸汽滅菌后后對金黃色葡萄球菌的抑制能力下降。李邦玉等[15]通過紫外可見光譜法研究發現，EGCG在高溫條件下會發生部分降解。在薄膜過濾法中，由于EGCG水溶性差，過濾時在0.22 μm無菌濾膜中有附著殘留，降低了實際有效抑菌濃度，導致其抑菌能力下降。由此可見，EGCG在溶劑中的溶解能力是影響其抑菌生物活性的重要原因，抑菌活性隨著溶解性的增大而增強，并呈現劑量依賴模式，這與申羽佳等[16]的研究結果是一致的。

EGCG在食品中的抑菌應用研究鮮有報道。駱曉波[17]制備了EGCG納米脂質體與EGCG納米脂質體可食用膜并將其應用于鱈魚保鮮，有效延長了保藏期，EGCG表現出良好的抑菌效果。同時有研究表明，茶多酚可應用于三文魚[18]、微凍鯽魚[19]等食品的貯藏保鮮和抑菌，而EGCG作為茶多酚的主要活性成分，也必然發揮重要的抑菌功能。然而該研究發現，EGCG在牛奶中的抑菌效果不顯著。研究發現，EGCG通過破壞細菌細胞膜、細胞壁結構或抑制生長代謝相關酶類活性，導致細菌結構變形和生長抑制甚至死亡[20-21]。而牛奶中的酪蛋白可與綠茶中EGCG等多酚類活性物質結合，致其抗菌能力減弱[22-23]。這可能是導致EGCG在牛奶中抑菌效果不顯著的主要原因之一。

鑒于EGCG在多種無菌化加工處理后仍具有優良的抑菌活性，在下一步作為食品添加劑的實際應用中，應考慮食物自身潛在的EGCG拮抗成分，以便實現合理、有效的應用。該研究為EGCG作為抑菌劑在食品防腐保鮮、生物防控以及藥物開發應用奠定了重要基礎。

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