三陰性乳腺癌患者外周血及腫瘤組織中CD4+ T淋巴細胞上Tim-3和PD-1的表達及其臨床意義

徐本玲 袁鵬 陳廣玉 王振雷 袁龍

(鄭州大學附屬腫瘤醫院 河南 鄭州 450008)

三陰性乳腺癌患者外周血及腫瘤組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1的表達及其臨床意義

徐本玲 袁鵬 陳廣玉 王振雷 袁龍

(鄭州大學附屬腫瘤醫院 河南 鄭州 450008)

目的 探討三陰性乳腺癌(BC)患者外周血、腫瘤組織和癌旁組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1的表達與BC疾病進展的關系。方法 收集鄭州大學附屬腫瘤醫院乳腺外科2013年1月至2014年1月收治的52例BC患者全血標本，并同時收集其中7例Ⅲ期患者的腫瘤組織和癌旁組織標本，采用密度梯度離心法分離獲得組織中的淋巴細胞，采用流式細胞學方法檢測CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1的表達水平。結果 52例BC患者外周血CD4+T淋巴細胞上Tim-3、PD-1和Tim-3+PD-1+的表達水平明顯高于其在22例健康人外周血中的表達水平(Tim-3∶2.74%比1.7%，P=0.026 4；PD-1∶17.15%比11.8%，P=0.000 6；Tim-3+PD-1+∶2.23%比1.13%，P=0.006 6)。Ⅲ/Ⅳ期BC患者外周血CD4+T細胞上Tim-3+PD-1+的表達水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期BC患者(3.23%比1.66%，P=0.021 6)及健康人。BC患者腫瘤組織中CD4+細胞表面Tim-3，PD-1和Tim-3+PD-1+的表達水平高于癌旁組織和外周血。結論 BC患者外周血及腫瘤組織中CD4+T細胞上抑制性受體Tim-3和PD-1的表達水平升高，可能是CD4+T細胞參與腫瘤細胞免疫逃逸，促進BC病情進展的機制之一。

乳腺癌；CD4+T淋巴細胞；T細胞耗竭；T細胞免疫球蛋白黏蛋白結構域相關分子3；程序性死亡分子1

乳腺癌(breast cancer，BC)是全球范圍內嚴重危害女性身體健康的惡性腫瘤[1]，尤其是三陰性BC，因其雌激素受體、孕激素受體及HER-2受體均為陰性，對化療及內分泌治療效果均很差，亟需尋找新的治療策略以提高患者的預后[2]。BC患者的預后不僅取決于腫瘤本身的特點，更重要的是還取決于機體與腫瘤的相互作用。越來越多的研究發現，免疫系統尤其是T細胞在清除或控制腫瘤形成中發揮重要作用，T細胞同時表達多個抑制性受體與耗竭的程度有關。近年來，CD4+T細胞作為機體細胞免疫功能的重要構成部分之一，其在腫瘤免疫治療中的作用逐漸引起人們的重視。T細胞免疫球蛋白黏蛋白結構域相關分子3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim-3) 和程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)是T細胞表面重要的共抑制分子，介導負性調節信號[3-4]。在一項關于免疫檢查點的研究中，Tim-3在腫瘤誘導的免疫抑制過程中發揮重要作用，在荷瘤動物模型中，Tim-3+CD8+T細胞亞群顯示更強的被抑制特性，并且出現功能障礙。封閉Tim-3則可以獲得和封閉PD-1相似的抗腫瘤效應[5]。CD4+T細胞表面Tim-3的表達在BC患者外周血、腫瘤組織及癌旁組織中有何變化，這些變化與BC的臨床病理資料有何關系，尚未見報道。鑒于上述原因，本研究通過流式細胞學檢測BC患者外周血及腫瘤組織、癌旁組織中CD4+T細胞上Tim-3及PD-1的表達情況并分析其臨床意義，旨在探討CD4+T細胞上免疫抑制性受體與BC發生和發展的關系，從而為三陰性BC的臨床治療提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選取2013年1月至2014年1月入住鄭州大學附屬腫瘤醫院乳腺外科的三陰性BC患者，連續入選。所有患者均為初診，術前未接受過放化療及其他治療。患者的年齡、性別、組織學分級、臨床分期等臨床資料均被采集。所有患者均由同一位外科醫生進行手術。本研究經鄭州大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會批準實施，標本采集均征得患者本人同意并簽署知情同意書。

1.2 標本采集 于手術前1 d分別收集三陰性BC患者的清晨空腹外周血標本兩管，一管用EDTA-Na2抗凝管采集，另一管用促凝管采集。并于標本收集后2 h內送到鄭州大學附屬腫瘤醫院生物免疫治療實驗室備用。采用相同方法抽取22例健康供者的外周血2 ml作為健康對照組。

組織標本的收集：患者簽署知情同意書后，于術中將切下的腫瘤組織及相對應的癌旁組織放到事先準備好的含有慶大霉素(900 IU/ml)，青霉素(500 IU/ml)和鏈霉素(500 μg/ml)的GTT-551無血清培養基中，立即送往實驗室進行下一步的實驗檢測。

1.3 腫瘤組織及癌旁組織中單細胞懸液的分離 分別將腫瘤組織和癌旁組織剪切成1～2 mm3的組織碎塊，分別放入配好的胰蛋白酶混合液中(含膠原酶Ⅰ1 μg/ml，膠原酶Ⅳ1 μg/ml，DNase 25 μg/ml，含2%的胎牛血清)，然后將細胞放入自動旋轉儀上，置于37 ℃培養箱中，每30 min觀察1次，根據組織消化情況終止反應(加入胎牛血清，其終濃度為5%)。采用Percoll組織樣本分離液，密度梯度離心分離獲得單細胞懸液備用。

1.4 實驗方法 流式細胞學方法檢測Tim-3和PD-1在CD4+T細胞上的表達：取外周抗凝血，腫瘤組織及癌旁組織單細胞懸液各100 μl，分別吸取熒光標記的特異性抗體(抗PD-1-FITC，抗CD4-PerCP-cy5.5，抗Tim-3-PE)各5 μl 加入流式管，混合均勻，置于冰上避光孵育 20 min。同時設各通道同型對照管以調補償。反應后的外周血流式管內加入紅細胞裂解液1 ml，振蕩混勻，避光放置于37 ℃恒溫箱中反應30 min，腫瘤組織及癌旁組織單細胞懸液管省去此步驟。取FACS緩沖液(含5%牛血清白蛋白和0.09%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液)2 ml，離心，棄上清，用300 μl的FACS緩沖液重懸后，采用FACS AriaⅡ流式細胞儀(BD Pharmingen)進行數據采集，應用FlowJo軟件進行數據分析，記錄陽性細胞比例。

1.5 統計學分析 應用GraphPad 5.0軟件進行統計分析。連續變量數據用中位數和范圍描述，外周血中Tim-3的表達與臨床病理參數的相關性用Mann-Whitney U test分析；有序變量之間的聯系用Spearman相關分析，相關系數用來確定變量因子之間相關的強度。定量資料采用平均數進行描述。腫瘤組織、癌旁組織及外周血中PD-1和Tim-3表達的差異采用成對t檢驗分析。所有檢驗均為雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入選患者的基本臨床特征 符合入選條件的患者共52例，入選患者的中位年齡為61歲(35～77歲)，22個年齡、性別與此相匹配的健康人的標本作為對照。入選研究對象的具體信息見表1。

表1 入選研究對象的臨床基本資料(n)

2.2 三陰性BC患者與健康人外周血中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1表達水平的比較 三陰性BC患者外周血中CD4+T淋巴細胞上Tim-3的表達水平為2.74%(0.83%～27.6%)，PD-1的表達水平為17.15%(4.1%～45.7%)，分別高于其在健康對照組外周血中的水平1.7%(0.52%～5.35%)，P=0.026 4(2.74%比1.7%，Tim-3)，11.8%(2.2%～16.9 %)，P=0.000 6(17.15%比11.8%，PD-1)。(圖1 A～C為代表性的流式圖，圖D～E為統計分析圖)。三陰性BC患者外周血CD4+T淋巴細胞上Tim-3+PD-1+的表達水平為2.23%(0.52%～26.6%)，明顯高于其在健康對照組外周血中的表達水平1.13%(0.14%～5.52%)，差異有統計學意義(P=0.006 6)(圖1F)。

圖1 三陰性BC患者外周血CD4陽性細胞上Tim-3和PD-1的表達水平與健康對照組比較

2.3 三陰性BC患者腫瘤組織與癌旁組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1的表達差異 CD4+T細胞上Tim-3在腫瘤組織中的表達明顯高于其在癌旁組織中的表達(27.2%比7.8%，P=0.000 6)，CD4+T細胞上PD-1在腫瘤組織中的表達亦明顯高于其在癌旁組織中的表達(44.05%比23.24%，P=0.006 9)，代表性的流式圖見圖2(A～C)，匯總的7個患者的統計圖見圖2(D～E)。進一步分析組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1的共表達情況，結果顯示：CD4+T細胞上Tim-3+PD-1+在腫瘤組織中的表達明顯高于其在癌旁組織中的表達(25.43%比7.28%，P=0.002 9)。三陰性BC患者腫瘤組織CD4+T淋巴細胞上Tim-3+PD-1+的表達明顯高于其在外周血中的表達(25.43%比5.78%，P=0.003 9，見圖2)。癌旁組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3+PD-1+的表達與其在外周血中的表達差異無統計學意義(7.28%比5.78%，P=0.052 5)。

圖2 三陰性BC患者癌組織、癌旁組織及其外周血中CD4陽性細胞上Tim-3和PD-1表達水平的比較

2.4 三陰性BC患者外周血CD4+T細胞上Tim-3+PD-1+表達水平與臨床資料的關系 由于Ⅰ期患者較少，本研究將Ⅰ期和Ⅱ期患者合并，入選的52例患者按照AJCC分期，Ⅰ/Ⅱ期患者共33例，Ⅲ/Ⅳ期三陰性BC患者19例，中分化及分化好的患者35例，低分化患者17例。Ⅲ/Ⅳ期三陰性BC患者外周血CD4+T淋巴細胞中Tim-3+PD-1+細胞的表達水平3.23%(0.7%～26.6%)高于Ⅰ/Ⅱ期患者的表達水平1.66%(0.52%～18.2%)，差異有統計學意義(P=0.021 6)。Ⅲ/Ⅳ期三陰性BC患者外周血CD4+T淋巴細胞中Tim-3+PD-1+細胞的表達水平亦明顯高于健康人的水平(3.23%比1.13%，P=0.001 6)，見圖3A。Ⅰ/Ⅱ期三陰性BC患者外周血CD4+T淋巴細胞中Tim-3+PD-1+細胞的表達水平稍高于健康人，但與健康人相比，差異無統計學意義(1.66%比1.13%，P=0.052 4)。中分化及分化好的患者外周血CD4+T淋巴細胞中Tim-3+PD-1+細胞的表達水平與低分化患者相比，差異無統計學意義(P=0.450 9)。見圖3B。

圖3 三陰性BC患者外周血中CD4+T淋巴細胞上Tim-3 和PD-1表達水平與臨床資料的關系

3 討論

T淋巴細胞在人體細胞免疫過程中發揮重要作用。大量的研究已經證實，調節T淋巴細胞活性的免疫調節因子(共刺激因子和共抑制因子)之間的相互作用，可以影響機體的免疫反應[6]。CD4+T細胞不僅可對CD8+T細胞的激活和增殖提供“輔助”，還可直接殺傷腫瘤細胞，在感染、免疫調節過程中也發揮重要作用[7]。

本研究發現三陰性BC患者外周血CD4+T細胞中Tim-3和PD-1的表達明顯高于健康人，這一研究結果與以往報道的在濾泡性淋巴瘤、口腔鱗癌及卵巢癌患者中的研究結果[8-9]一致。此外，Tim-3的高表達不僅存在于腫瘤患者體內，在一些病毒感染的患者體內也存在Tim-3的高表達。HIV感染患者耗竭的CD4+T細胞上也高表達Tim-3，相似的在HCV、HBV感染患者耗竭的T細胞上也都有Tim-3的表達[10]。

在慢性HCV感染時，CD4+和CD8+T細胞上Tim-3均升高，且大部分細胞為Tim-3+PD-1+。與慢性病毒感染時一樣，在小鼠BC和惡性黑色素瘤的腫瘤浸潤組織CD4+和CD8+淋巴細胞上可見Tim-3和PD-1共表達[11]。本研究結果顯示，三陰性BC患者外周血CD4+T細胞中Tim-3+PD-1+的表達亦明顯高于健康人，這一結果與惡性黑色素瘤患者研究結果一致，提示Tim-3+PD-1+的表達可能導致CD4+T細胞的功能耗竭，可能是CD4+T細胞參與腫瘤細胞免疫逃逸、促進BC疾病進展的機制之一。

三陰性BC患者腫瘤組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3+PD-1+的表達明顯高于其在癌旁組織和外周血中的表達，提示腫瘤微環境中可能存在誘導Tim-3和PD-1表達的細胞因子，進而導致CD4+T細胞功能障礙，導致腫瘤細胞免疫逃逸，促進腫瘤發展。因此，了解和研究腫瘤組織、癌旁組織中Tim-3和PD-1的表達及功能可能更能反映腫瘤的發生發展情況。Zhu等[12]近期研究了Tim-3+在BC患者CXCL13浸潤的CD4輔助細胞上Tim-3的表達，但未分析Tim-3和PD-1在外周血與腫瘤組織中表達的差異。研究發現，非小細胞肺癌患者PD-1+CD4+的表達與腫瘤分期相關[13]。Wang等[14]則分析了Tim-3多態性與中國人患BC的易感性之間的關系，發現TIM-3上rs10053538可能增加BC的易感性，并促進其病情發展，但并未分析Tim-3與BC臨床分期的關系。

本研究發現Ⅲ/Ⅳ期三陰性BC患者外周血CD4+的細胞中Tim-3+PD-1+細胞的表達水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者的水平，也明顯高于健康人的水平，而Ⅰ/Ⅱ期患者的水平與健康人相比無明顯差別，提示Tim-3+PD-1+CD4+的表達可能與三陰性BC的病情進展和腫瘤負荷有關。此外，Tim-3+PD-1+CD4+的表達水平在晚期腫瘤患者體內增高也可能和腫瘤微環境有關。Ⅰ/Ⅱ期患者的水平僅輕度升高，但與健康人相比無明顯差別，這可能與腫瘤發展初期循環外周血中腫瘤抗原少，抗原刺激所產生的特異性T細胞活性較好，抑制性信號較弱，T細胞清除異常抗原的功能并沒有明顯改變。另一方面，這也可能和樣本量少有關。此外，通過分析發現，CD4上Tim-3的表達與三陰性BC的組織分化程度不相關。

此項研究結果豐富了人們對Tim-3和CD4+T細胞的認識，為臨床醫師分析腫瘤患者病情，理解三陰性BC的病情進展提供了重要參考。為進一步深入研究腫瘤組織對Tim-3和PD-1的影響奠定了實驗基礎。隨著研究的不斷深入，Tim-3在慢性病毒感染和腫瘤免疫逃逸中的作用及相關機制會逐步得到闡明，進而臨床上可以靶向Tim-3治療腫瘤，利用抗Tim-3抗體治療自身免疫病和移植排斥，并不斷為移植免疫排斥、腫瘤靶向治療、腫瘤疫苗的應用等,提供新的治療技術。

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Expression and clinical significance of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes in three-negative breast cancer patients

Xu Benling, Yuan Peng, Chen Guangyu, Wang Zhenlei, Yuan Long

(TheAffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China)

Objective To detect the expression of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes in three-negative breast cancer (BC) patients and investigate their potential relationship with the progression of BC. Methods Fifty-two patients with three-negative BC in Department of Breast Surgery, the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University from January of 2013 to January of 2014 were enrolled. All the Peripheral blood and 7 cases of tumor and paraneoplastic tissues from surgically treated BC patients were obtained. The expression of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes were analyzed by flow cytometry. Results The frequencies of Tim-3+cells, PD-1+cells and Tim-3+PD-1+cells among CD4+cells were significantly higher in BC patients than those in the 22 healthy donors (Tim-3: 2.74%vs1.7%,P=0.026 4; PD-1: 17.15%vs11.8%,P=0.000 6; Tim-3+PD-1+: 2.23%vs1.13%,P=0.006 6). Significant difference was observed for the Tim-3+PD-1+CD4+percentage in stage Ⅲ/Ⅳ patients compared to the patients with stage Ⅰ/Ⅱ (3.23%vs1.66%,P=0.021 6) and healthy donors. Compared with the matched paraneoplastic tissue and their counterparts in blood, the percentage of Tim-3+cells, PD-1+cells and Tim-3+PD-1+cells in tumor-infiltrating CD4+T cells were significantly increased in the tumor tissues. Conclusion The frequencies of Tim-3+cells among CD4+cells were significantly increased in BC patients, indicating that Tim-3+PD-1+CD4+T cells may be one of the mechanisms related to immune escape of tumor cells, acceleration of the development of BC.【Key words】 Breast cancer; CD4+T-lymphocytes; T cell exhaust; Tim-3; PD-1

河南省醫學科技攻關計劃重大項目(201401016)；

河南省留學人員科研資助項目(豫留學函2015-5號)；

袁龍，E-mail：13673633569@163.com。

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.07.008

2016-09-07)

鄭州市技術研究與開發經費支持項目(153PKJGG061)。