某區慢性阻塞性肺疾病下呼吸道感染的病原菌檢測、藥敏結果及臨床價值

2017-07-12 14:04:01謝志斌彭梅君葉艷珍

中國醫藥指南 2017年14期

關鍵詞：耐藥

曾曉謝志斌劉鈞彭梅君楊青葉艷珍張鵬

（湖北省孝感市中心醫院呼吸內科三，湖北孝感 432000）

某區慢性阻塞性肺疾病下呼吸道感染的病原菌檢測、藥敏結果及臨床價值

曾曉謝志斌*劉鈞彭梅君楊青葉艷珍張鵬

（湖北省孝感市中心醫院呼吸內科三，湖北孝感 432000）

收集孝感市中心醫院慢性阻塞性肺疾病痰標本306例，標本直接涂片革蘭染色細胞學計數，同時觀察白細胞和病原菌關系的現象，并收集患者相關臨床資料。綜合三方面對所生長的潛在病原菌進行判斷。以患者依據藥物敏感實驗結果、用藥后的療效以及有無感染癥狀體征為判斷依據。白細胞吞噬細菌或與細菌并存現象的標本有135份培養的細菌均確定為感染病原菌，感染率顯著高于未觀察到白細胞吞噬病原菌或與病原菌并存現象的標本（100% vs 23.2%，P＜0.005）。下呼吸道感染分離的病原菌主要以革蘭陰性桿菌為主，位列前五位的依次為肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌；分離的革蘭陽性球菌主要以金黃色葡萄球菌為主，第二位的是肺炎鏈球菌；分離出的真菌仍主要以念珠菌屬為主（占真菌62%）本研究分離的肺炎克雷伯菌對常用抗生素的耐藥率較高，除亞胺培南、阿米卡星耐藥率低于30%，其他抗生素均高于30%，大腸埃希菌對亞胺培南的耐藥率低于10%，對環丙沙星耐藥率超過70%；銅綠假單胞菌對阿米卡星、亞胺培南、頭孢他啶的耐藥率均低于30%，革蘭陰性菌整體對氨芐西林、頭孢唑林的耐藥率較高，分別達85.8%、82.6%。未發現對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌。結論下呼吸道感染分離的病原菌主要以革蘭陰性桿菌為主。革蘭陰性桿菌對亞胺培南、阿米卡星具有較高的敏感性。革蘭陽性球菌對萬古霉素無耐藥。確定病原菌必須綜合患者的臨床資料，直接涂片的表現，細胞學及白細胞與病原菌的關系和培養生長情況三個方面來確定感染病原菌。

慢性阻塞性肺疾??；下呼吸道感染；病原菌檢測；藥敏；臨床價值

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）急性加重期的定義：AECOPD是指COPD患者“急性起病，患者的呼吸困難、咳嗽和（或）咳痰癥狀變化超過了正常的日間變異，須改變原有治療方案的一種臨床情況”。其最常見的原因是支氣管樹的感染和大氣污染[1]，由于口咽部有大量正常生理菌群，咳痰標本受口咽部生理菌群污染不可避免。對于典型的致病菌如白喉棒狀桿菌、百日咳鮑特菌等，不受口咽部生理菌群影響，分離培養出即可視為病原菌。然而，隨著醫療技術的提高，抗生素的廣泛使用，典型的致病菌感染越來越少見，而條件致病菌的感染卻逐漸上升。因此，對于痰標本培養出的條件致病菌如何判斷其為呼吸道感染定植菌還是感染菌已經成為臨床檢驗的難點，本文采用一種新的可用于判斷痰液培養定植菌和病原菌的方法，結合藥敏試驗，以了解本院慢性阻塞性肺病患者的病原學特點及指導如何合理使用抗生素。

1 材料與方法

1.1 研究對象：選取本院2014年1月1日至2015年1月1日間住院患者痰標本306份。

1.2 標本處理

1.2.1 標本直接涂片，厚薄均勻，自然干燥后火焰固定，革蘭鏡檢。

1.2.2 鏡檢內容：①細胞學檢查：包括鱗狀上皮（SEC）和中性粒細胞。依據《全國臨床檢驗操作規程》第二版下呼吸道標本顯微鏡白細胞和鱗狀上皮細胞計數判斷標準[2]及美國第7版《臨床微生物學》。相關標準：將標本分為A、B、C 三類（表1）；②細菌學檢查：包括口咽部生理菌群（甲型溶血性鏈球菌、非治病奈瑟菌及厭氧菌等）和潛在病原菌；③細菌和細胞之間的關系：觀察致病菌和中性粒細胞之間的關系，包括中性粒細胞吞噬細菌或細菌與細胞并存的現象。

1.3 標本培養：所有標本均接種羊血平板、巧克力平板和中國藍平板，培養基半成品購自美國BD公司。

1.4 細菌鑒定：VⅠTEK全自動微生物鑒定系統，按儀器說明書操作。藥敏紙片法:按2005年美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）的紙片擴散法進行及判斷結果。超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林葡萄球菌（M RS）的檢測、篩選及確診試驗參照2005 年NCCLS推薦標準。觀察三種平板生長情況，如果培養基有細菌生長，量達到1區以上即為陽性（一區密集生長為1+，二區生長為2+，三區生長為3+），進行鑒定和藥物敏感試驗，鑒定采用法國梅里埃公司VⅠTEK鑒定系統，藥物敏感試驗采用K-B法。

1.5 質量控制：選取ATCC 25922大腸埃希菌和ATCC25923金黃色葡萄球菌為質控菌株對上述實驗過程進行質量控制。

1.6 病原菌確定標準：患者具有感染癥狀且依據藥敏結果用藥后治療有效。

1.7 定植菌確定標準：患者無感染癥狀或有感染癥狀但依據藥敏結果用藥后治療無效。

1.8 按照《全國臨床檢驗操作規程》將老年患者痰標本接種在血瓊脂和伊紅美藍培養基培養 18～24 h，觀察菌落形態，進行革蘭染色。應用VTEK自動細菌鑒定儀將細菌鑒定到種并進行藥物敏感試驗，抗生素包括亞胺培南西司他丁、哌拉西林他唑巴坦、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢美唑、頭孢唑啉、左氧氟沙星、舒普深、環丙沙星、青霉素、氨芐青霉素、苯唑西林、萬古霉素、阿米卡星、慶大霉素、SMZ-CO、紅霉素、利福平等，按NCC、LS標準用K-B法進行藥敏試驗，藥敏結果統計用VTEK統計軟件進行分析[2]。

1.9 統計學分析：采用SPSS 12.0統計分析軟件進行處理，計數資料均用率表示，采用卡方檢驗，P＜0.05，具有差異統計學意義。

表1 痰液標本細菌培養合格標準

2 結果

2.1 陽性患者一般情況：306例患者年齡17～94歲，平均年齡68.4歲，其中70歲以上老年患者211例，占68.9%。男性患者224例，占73.2%。女性患者82例，占26.7%，有感染癥狀及體征者249例，占81.3%，無感染癥狀及體征者57例，占18.6%。培養前有使用抗生素274例，占89.5%，未使用抗生素者32例，占10.5%。

2.2 痰培養陽性細菌分布：共培養出致病菌305株，革蘭陰性菌220株，占72.13%；革蘭陽性球菌60株，占19.67%；真菌26株，占8.52%；其中培養出多重耐藥菌69株，陽性率22.6%。

2.3 不同質量標本培養出的細菌之間定植率和感染率的比較：305株菌依據上述判斷標準，確定為病原菌的構成比為48.3%，合格標本244份（79.7%），其中A類131份、B類113份。不合格標本C類62份。兩類標本培養的細菌定植率和感染率比較結果見表2。在A類和B類中依據直接涂片鏡檢結果（是否具有感染免疫病理現象即中性粒細胞吞噬相應細菌或與細菌并存）分為兩類，二者之間定植率與感染率的比較見表3。

2.4 不同種類細菌的感染率和定植率不同，肺炎球菌，流感桿菌，卡他的感染率為100%，非發酵菌定植率為71.3%。見表4。

2.5 慢性阻塞性肺疾病培養的細菌以革蘭陰性菌為主，占72.13%，革蘭陽性球菌占19.67%，真菌占8.25%。其中革蘭陰性菌以肺炎克雷伯菌（14.75%）、銅綠假單胞菌（13.44%）、不動桿菌（10.82%）為主。革蘭陽性球菌以金黃色葡萄球菌（6.88%）、肺炎鏈球菌（5.57%）、表皮葡萄球菌（3.28%）、腸球菌（1.64%）。見表5。

2.6 采用臨床常用的18種抗生素對分離的COPD感染的主要革蘭陰性病原菌進行耐藥分析，本實驗對4中主要的革蘭陰性致病菌（肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌、大腸埃希菌）進行耐藥測定，發現革蘭陰性菌整體對氨芐西林、頭孢唑林、氯霉素耐藥率最高，分別達到85.8%、82.6%、65.3%。對亞胺培南、頭孢他啶、妥布霉素的耐藥率最低，分別達到16.7%、30.3%、31.1%。見表6。

2.7 采用臨床常用的13種抗生素對分離的COPD感染的主要革蘭陽性球菌進行耐藥分析，本實驗中對3種常見的革蘭陽性球菌（金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、表皮葡萄球菌）進行耐藥性分析，發現革蘭陽性球菌整體對青霉素、紅霉素、氧氟沙星耐藥率最高，分別達95%、88.6%、79.3%。對萬古霉素、呋喃妥因、亞胺培南耐藥率最低，分別為0%、19.1%、25.4%。未發現對萬古霉素耐藥的革蘭陽性球菌。見表7。

3 討論

當今社會科學技術飛速發展，隨著抗生素的廣泛使用，下呼吸道的感染病原菌不斷變遷，過去典型的致病菌已經相對少見，相反，現在由條件致病菌導致的感染卻不斷增多，已成為下呼吸道感染的主要病原菌。典型的病原菌有典型的臨床表現和特點，而且不受口咽部定植菌的影響，實驗室檢查出即可確診。而條件致病菌的致病性是相對的，無典型的臨床表現，而且不能通過實驗室培養來確定是致病菌還是口腔定植菌，因此成為了臨床醫學的難點。

目前，痰培養是最廣泛應用的病原學診斷技術，本例研究中，306例患者中，痰培養前使用抗生素274例，占89.5%，在這些患者中，機體免疫力低下，一般致病菌定植力遭到破壞，而定植力較強，侵襲力較弱的條件致病菌卻很容易在呼吸道定植而成為致病菌。而痰培養出這些條件致病菌或連續兩次以上分離出，即使患者有呼吸道癥狀和體征，也不能判斷這些條件致病菌就是致病菌。

正常呼吸道存在大量生理菌群，通過營養競爭，占位保護等作用拮抗外來菌群的定植，機體的完整的黏膜也是重要的防御屏障。當外界多種致病因素如機體免疫力破壞，抗生素的過度使用等因素造成機體防御能力的下降，則病菌可入侵機體。如此同時，機體產生的炎性反應，包括炎性細胞的趨化（主要是白細胞）至炎癥部位，識別并吞噬殺滅病原體[3]。因此，下呼吸道感染患者，不論是典型的致病菌還是條件致病菌感染，都會引起炎性反應，有白細胞趨化并吞噬殺滅病原菌的病理現象。其咳痰中必定帶有大量的白細胞，直接涂片細胞學檢查有助于致病菌與定植菌的判斷。表2提示，合格標本分離出的病原菌顯著高于不合格標本（61.9% vs 3.2%，P＜0.005），不合格標本幾乎都是上呼吸道定植菌（96.8%）。白細胞吞噬異物（病原菌）是一種非特異性的免疫病理防御機制，即便是正常人的呼吸道中也有少量白細胞存在，因此咳痰標本即使合格其可接受的標本單純細胞學計數也無法確定所培養的條件致病菌為感染病原菌。表2表明，合格標本仍有93例（39.7%）為定植菌。如前所述，白細胞浸潤吞噬病原菌是機體炎性反應過程中必然的免疫病理現象，來自呼吸道炎癥部位的咳痰一定有白細胞吞噬病原菌或與病原菌并存的現象，見圖1，根據這一現象可以作為判斷細菌為病原菌的直接證據。表3表明，本組研究中有白細胞吞噬伴行現象的感染率顯著高于沒有白細胞吞噬伴行的感染率（100% vs 21.2%，P＜0.005）。因此，痰標本中見到白細胞吞噬病原菌或與病原菌伴行現象的可以判斷該細菌為致病菌。在未見白細胞吞噬伴行現象的合格標本中有24例（21.2%）為感染致病菌，這一現象可能與涂片敏感性有關。根據培養，可將病原菌分為四類，非發酵菌，腸桿菌科，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，卡他菌及葡萄球菌，不同種類細菌之間的感染率和定值率之間有顯著性差異（P＜0.005），這與不同細菌之間的毒力，定值能力，侵襲力的不同有關。

表5 慢性阻塞性肺病感染病原菌種類及構成比

圖1 痰培養定植菌與致病菌的判斷

研究結果提示，革蘭陰性桿菌是引起下呼吸道感染的主要致病菌，革蘭陽性球菌相對較少。除了萬古霉素沒有耐藥以外，致病菌對其他的抗生素均有不同程度耐藥。由于氨芐西林的廣泛應用，細菌已經對其產生了很高的耐藥性，肺炎克雷伯菌對氨芐西100%耐藥，不宜作為首選用藥。本試驗銅綠假單胞菌對氨芐西林、頭孢唑啉、氨曲南的耐藥率達到76.8%～90.2%，臨床中可選擇低耐藥的阿米卡星、亞胺培南和頭孢他啶，革蘭陽性球菌整體對青霉素、苯唑西林，氧氟沙星、紅霉素耐藥率較高，對萬古霉素不耐藥，可作為感染時選用。對臨床上常用的抗生素其耐藥率較高，臨床應用時應該注意聯合用藥以降低細菌耐藥的發生。對年老體弱，長期大量使用抗菌藥物治療者，應特別警惕，盡早送檢痰培養根據藥敏試驗報告，合理選擇抗菌藥物，調整經驗用藥，減少細菌耐藥性的產生及菌群失調的產生[4]。