應用TALENs技術定向敲除煙草eIF4E—6基因

宋琳娜 楊鵬九 萬秀清 喬嬋 潘洪杏 郭振楠 劉俠 郭兆奎 李若

摘要 [目的]利用TALENs技術定向敲除煙草eIF4E-6基因，為提高優質烤煙品種K326 的馬鈴薯Y病毒（PVY）抗性提供材料。 [方法]構建特異靶向煙草eIF4E-6基因的TALENs載體，并由農桿菌介導轉化K326煙草，用PCR和克隆測序方法篩選目的基因被成功編輯的T0代轉基因煙株。 [結果]構建了2個特異靶向eIF4E-6基因的TALENs載體T3和T4。2個載體各獲得了約40和50株陽性轉化的K326 T0代煙株。T3載體獲得1株目的基因靶位點發生大片段堿基缺失的雜合突變型T0代單株、3株靶位點發生堿基替換的雜合突變型T0代單株。T4載體獲得5株靶位點發生堿基替換的雜合突變型T0代單株。 [結論]利用TALENs技術獲得的eIF4E-6基因雜合突變型K326 T0代單株為后續獲得純合基因敲除的K326煙草，并最終獲得PVY病毒抗性改良的K326煙草材料奠定了基礎。

關鍵詞 煙草；PVY；K326；eIF4E-6基因；TALENs

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0142-05

The Directional Knockout of eIF4E-6 Gene Using TALENs Technique

SONG Lin-na1，2，YANG Peng-jiu3，WAN Xiu-qing2，LI Ruo2* et al （1.Mudanjiang Normal University，Mudanjiang，Heilongjiang 157100；2.Mudanjiang Tobacco Science Research Institute，Mudanjiang，Heilongjiang 157011；3.Heilongjiang Tobacco Monopoly Bureau，Harbin，Heilongjiang 150010）

Abstract [Objective] To knockout eIF4E-6 gene using TALENs technique，and to provide material for improving the PVY resistance of high-class flue-cured tobacco cultivar K326.[Method] TALENs vectors that specifically targeting against eIF4E-6 gene were constructed.TALENs vectors transformed tobacco cultivar K326 mediated by Agrobacterium tumefaciens.The T0 transgenic tobacco plants of which eIF4E-6 gene were successfully edited were screened.[Result] Two TALENs vectors which specifically targeted against eIF4E-6 gene were constructed in this study.Two vectors obtained approximately 40 and 50 positively transformed T0 tobacco plants respectively.Vector T3 obtained 1 heterozygous mutant T0 plant whose targeting site of eIF4E-6 gene showed deletion of big base fragment and 3 heterozygous mutant plants whose targeting sites showed single base substitution.Vector T4 obtained 5 heterozygous mutant T0 plants whose targeting sites showed single base substitution.[Conclusion] These heterozygous mutant T0 K326 tobacco plants obtained by using TALENs technique laid foundation for obtaining homozygous gene knockout K326 tobacco and finally obtaining K326 tobacco with improved PVY resistance.

Key words Tobacco；PVY；K326；eIF4E-6 gene；TALENs

馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）是近年來危害煙草生產的重要病害之一，嚴重影響煙草的產量和質量[1]。培育煙草PVY抗病品種是解決這一病毒性病害的有效途徑。前期研究中，從普通栽培煙草中鑒定了一個真核生物翻譯起始因子4E（Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E，eIF4E）基因家族成員eIF4E-6基因，基因功能研究結果表明其為煙草PVY病毒的感病基因。可見，通過基因組編輯技術敲除煙草PVY感病基因eIF4E-6來培育PVY抗病煙草成為可能。

轉錄激活樣效應因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）技術是近年新興的基因組編輯技術，已在動植物的基因組改造、基因功能研究等各個生物技術領域得到廣泛應用。TALENs通過DNA識別模塊靶向特異性的DNA位點并結合，然后由其Fok Ⅰ 核酸酶切斷該位點的DNA雙鏈。DNA雙鏈斷裂觸發生物細胞固有的DNA損傷修復機制，細胞或通過非同源末端連接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）的方式在靶位點DNA引入一定數目的堿基刪除、插入以實現對目的基因的敲除，或在提供供體模板的情況下通過同源修復（Homology-Directed Repair，HDR）的方式對靶位點DNA實現點突變、片段或基因的替換、敲入。由于TAL蛋白的DNA特異識別單位是間隔32個恒定氨基酸殘基的二聯氨基酸，而二聯氨基酸與A、G、T、C 這4個核苷酸堿基具有一一對應關系，因此利用模塊化的串聯TAL蛋白就可以靶向任意DNA序列。該研究利用TALENs技術對煙草eIF4E-6基因進行特異性敲除，以期改良優質烤煙品種K326的PVY抗病性。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙品種K326種子由牡丹江煙草科學研究所提供。特異靶向普通煙草eIF4E-6基因的TALENs載體PTALED-LR（分別命名為T3及T4）訂購自北京唯尚立德生物科技有限公司（圖1）。MS（Murashige & Skoog Medium）及1/2 MS植物組織培養基購自Duchefa Biochemie公司（荷蘭）。潮霉素B（Hygromycin B）購自Roche公司（瑞士）。質粒DNA小量純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0）、植物基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit）、DNA片段純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0）、pMD18-T載體、大腸桿菌感受態細胞（E.coli DH5α Competent Cells）、農桿菌感受態細胞（Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells）、普通Taq酶（TaKaRa TaqTM）、Ex Taq酶（TaKaRa Ex Taq）均購自寶生物工程（大連）有限公司。該研究所用PCR引物及序列見表1，所有引物由上海立菲生物技術有限公司（北京）合成。 其他試劑為化學分析純。

1.2 方法

1.2.1 構建靶向eIF4E-6基因的TALENs載體。

首先確定目的基因的靶序列。①根據TALENs載體靶序列選擇原則，TALENs識別臂識別堿基數量為16～18，識別位點第0個堿基為T或者C，間隔序列為14～18個堿基；②根據在線Blast及與中國煙草基因組數據庫數據比對情況，確定eIF4E-6基因的特異靶位點2個，分別命名為T3和T4，靶位點序列信息見表2。根據靶位點序列，由北京唯尚立德生物科技有限公司合成TALENs載體，并用熒光素酶（Luciferase）單鏈退火（Single Strand Annealing，SSA）報告基因方法檢測TALENs載體的體外DNA剪切活性。

1.2.2 TALENs載體遺傳轉化K326煙草。

首先將TALENs載體質粒電擊轉化農桿菌，具體步驟如下：將1 μg質粒放入解凍后的農桿菌LBA4404感受態細胞中，冰浴30 min；將混合液移入電擊杯中，2 500 V/6 ms進行電擊；然后加入500 μL SOC培養基，28 ℃、170 r/min振蕩培養60 min；取150 μL菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上，28 ℃培養2～3 d至單菌落出現。挑取單菌落進行菌落PCR驗證。菌落PCR 反應體系為總體積20 μL，其中10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 1.6 μL，無菌水14.1 μL，上下游引物（TEST-F和TEST-R各10 μmol/L）各0.5 μL，r-Taq酶0.3 μL，菌液1 μL。PCR擴增條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸6 min。PCR反應完成后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增載體潮霉素B抗性標簽的PCR產物大小為801 bp。

其次制備K326煙草無菌苗，具體步驟如下：將K326煙草種子放入滅菌的1.5 mL離心管中，用0.2%升汞消毒5 min，無菌水沖洗3～5次，按8粒/瓶播種于1/2 MS固體培養基 （MS大量元素減半+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH=5.8）上，培養條件為25 ℃，光照16 h/d。

最后采用葉盤法轉化K326煙草，具體步驟如下：待無菌苗長出4片葉子后，剪成約5 mm × 5 mm的小塊，用MS固體培養基預培養2 d。擴繁轉化成功的菌液，離心后用1/2 MS液體培養基重懸菌體。用重懸的菌液侵染煙草葉盤5 min，然后將被侵染的煙草葉盤置于含有2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS固體培養基中，23 ℃暗培養2 d。共培養后，在培養基中添加500 mg/L頭孢曲松鈉和10 mg/L潮霉素B進行篩選，誘導抗性愈傷組織的產生。待不定芽長到1～2 cm時，切下不定芽并轉移到含250 mg/L頭孢曲松鈉和10 mg/L潮霉素B的生根培養基上進行生根培養后獲得T0代K326煙株。

1.2.3 篩選T0代陽性轉基因K326煙株。

分別取T0代K326煙株和非轉基因對照煙株鮮嫩葉片，用植物基因組DNA提取試劑盒提取煙草葉片DNA，以此為模板進行PCR檢測。PCR反應體系為10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 2 μL，上下游引物（hygromycinB-F2和hygromycinB-R2各10 μmol/L）各1 μL，普通Taq酶0.25 μL，模板DNA 1 μL，加無菌水至25 μL。PCR擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸7 min。擴增潮霉素B載體抗性標簽，預期PCR產物大小為968 bp，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.2.4 T0代K326煙株eIF4E-6基因突變檢測。以T0代K326煙株葉片DNA為模板，進行PCR反應檢測突變。PCR反應體系為10 × Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 2 μL，上下游引物（eIF4E6TALEN4&5-F2和eIF4E6TALEN4&5-R2各10 μmol/L）各1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，無菌水17.25 μL，模板DNA 1 μL。 PCR 擴增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。PCR反應完成后取少量PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA片段純化試劑盒純化剩余PCR產物，然后將純化的PCR產物連接到pMD-18T載體，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，經藍白斑篩選每板挑取10個陽性菌落，搖菌后送上海立菲生物技術有限公司（北京）測序。用DNAMAN6、DNASTAR7等序列分析軟件分析T0代K326煙株eIF4E-6基因在TALENs靶位點處產生DNA序列和相應氨基酸序列改變的情況。

2 結果與分析

2.1 TALENs載體體外DNA剪切活性檢測

采用Luciferase-SSA報告基因方法對構建的2對TALENs載體T3和T4進行體外DNA剪切活性檢測，結果如圖2所示。相對于陰性對照，T3及T4載體的相對熒光強度分別達3.7倍和5.4倍，說明2個載體對相應靶位點DNA均具體外剪切活性，可以用于體內試驗。

2.2 K326煙草的遺傳轉化

TALENs載體電擊轉化農桿菌，菌液PCR檢測載體上的潮霉素B抗性標簽，結果如圖3所示。2個載體轉化的菌落均擴增出約800 bp大小的條帶，與預期801 bp大小PCR產物相符，說明載體已成功導入農桿菌。

2.3 T0代陽性轉基因K326煙株的篩選 經潮霉素B抗性篩選，最終2個TALENs載體各獲得約50和80株T0代再生K326煙株。提取再生煙株及非轉基因K326煙草葉片DNA，PCR檢測潮霉素B抗性標簽以篩選陽性轉基因煙株，代表性結果如圖4所示。大部分T0代再生煙株均能擴增出約1 kb大小的特異性條帶，與預期的PCR產物大小968 bp一致，說明這些煙株已被TALENs載體成功轉化。最終，2個TALENs載體各獲得約40和50株陽性轉基因煙株。

2.4 T0代轉基因K326煙株eIF4E-6基因突變檢測

在eIF4E-6基因TALENs靶位點兩側序列設計引物（eIF4E6TALEN4&5-F2和eIF4E6TALEN4&5-R2），PCR特異擴增T0代陽性轉基因K326煙株及非轉基因K326煙草目標基因片段，代表性結果如圖5所示。作為陰性對照的非轉基因K326煙草擴增出單一的約200 bp大小的PCR產物，與預期PCR產物大小222 bp相符。后續對該產物測序結果表明，產物序列與eIF4E-6基因序列完全一致。這說明該對引物可用于eIF4E-6基因靶位點序列的測定。但是，絕大部分2個載體轉化的T0代陽性轉基因K326煙株得到的該基因片段的大小與陰性對照一致。這預示著，這些T0代轉基因K326煙株的eIF4E-6基因在TALENs靶位點處可能未出現大片段的缺失或插入。

將擴增eIF4E-6基因靶位點序列的PCR產物連入T載體，進行克隆測序，并與非轉基因K326煙草該片段序列比對，序列分析結果如圖6所示。由圖6A可知，T3轉基因煙株T3-26 eIF4E-6基因由靶位點處開始出現49 bp的DNA片段缺失；單株T3-38、45、46則分別在TALENs載體Fok Ⅰ 核酸酶剪切位點出現單個堿基替換。由圖6B可知，這些核酸序列的突變導致這些單株eIF4E-6基因翻譯蛋白分別出現了蛋白翻譯提前終止或單氨基酸殘基的替換。由圖6C、6D可知，T0代T4轉基因煙株有5個單株T4-14、15、21、34、44在靶位點出現單堿基替換，導致靶位點處單氨基酸殘基的替換。需要說明的是，這些突變均為雜合型突變，即每個單株克隆測序序列中仍有與野生型eIF4E-6基因完全一致的序列，而實際上一致的序列占多數。對部分T0代單株PCR產物直接測序的結果也驗證了這一點，產物中占多數的未發生突變的eIF4E-6基因片段序列掩蓋了占少數的突變序列。最終，這些eIF4E-6基因雜合突變的T0代轉基因K326煙株為后續基因純合突變后代的獲得提供了材料。

3 結論與討論

PVY病毒是危害煙葉生產的重要病害，長年對我國煙葉生產造成重大經濟損失。PVY病毒是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的典型成員。近年發現，eIF4E蛋白是植物抗/感Potyvirus病毒的決定因子[2]。例如辣椒中抗PVY和煙草蝕紋病毒（Tobacco Etch Virus，TEV）的pvr2基因[3]，擬南芥中抗蕪菁黃葉病毒（Turnip Mosaic Virus，TuMV）和生菜花葉病毒（Lettuce Mosaic Virus，LMV）的lsp1基因[4，5]，生菜中抗LMV的mo1基因[6]等，不同植物物種中的所有這些Potyvirus病毒抗性相關基因都最終被鑒定為eIF4E基因家族成員。基于此，前期在普通栽培煙草中找到1個eIF4E-6基因，通過基因功能研究試驗鑒定其為PVY感病基因。目前煙草抗PVY育種中采用的主要抗源是va基因[7]，它是1個控制煙草PVY抗性的單隱性抗病基因。在法國，有77.5%的煙草栽培品種含有此抗源[8]。2014年Julio等[9]確定普通煙草中的eIF4E基因家族中一成員（GenBank序列號KF155696），即對應va基因。經序列比對，該研究中的eIF4E-6基因與Julio等報道的KF155696序列完全一致。基于以上研究，通過目前的基因組編輯技術可以定向敲除普通煙草中PVY感病基因eIF4E-6，從而實現對煙草栽培品種的抗性改良。

近年來，基因組編輯技術的出現及迅速發展為實現作物的精準遺傳改良提供了強大技術支撐。最初的基因組編輯工具鋅指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases），因其在基因組作用靶點范圍、基因編輯效率、組裝技術難度、脫靶概率及突變遺傳復雜性等方面的局限，而逐漸被后續出現的TALENs及CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-associated Protein 9）技術取代。TALENs技術近年來已成功應用于酵母、蛔蟲、大鼠、斑馬魚、人胚胎干細胞等眾多生物的靶向基因組編輯[10]，其中也包括水稻、擬南芥、煙草等多種植物物種[11]。該研究利用這一技術通過定向敲除煙草PVY感病基因來改良煙草的抗病性。由于該研究的目標基因eIF4E-6屬于1個包含多達12個成員的基因家族，且成員間編碼序列一致度高，所以最終僅選擇2個靶點。依據靶點序列構建的TALENs載體在導入煙草前對其體外DNA剪切活性進行了檢測，結果顯示T4載體的活性高于T3。但最終T0代轉化煙草的目標基因突變檢測結果

表明T3

載體對目標基因的編輯效果要略優于T4。這說明，TALENs載體的體外活性可能并不能準確預測其在植物體內的基因組編輯效果。當然，由于該研究2個載體基因編輯效率較低，且獲得的T0代煙株數量不足夠大，這一結果需要更大數量后代材料的驗證。從2個載體獲得的T0代煙株目的基因的整體突變情況來看，突變均為雜合型且多數為單堿基替換，2個載體基因編輯效率偏低。這可能由于該研究所用的早期的（2013年）TALENs載體基因編輯效率不高[11]，也可能受到該研究目標基因與其他非靶標基因同源性的限制。

綜上所述，該研究利用TALENs基因組編輯技術獲得了eIF4E-6基因雜合突變型的T0代K326煙株，為將來獲得純合基因敲除的PVY抗性改良的煙草品種提供了材料。

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