鐵皮石斛不同外植體組培快繁技術比較

饒寶蓉 陳泳和 江文清 劉忠輝 梁彥 陳琦輝

摘要 [目的]篩選適宜鐵皮石斛繁殖的最佳方法。[方法]以鐵皮石斛成熟蒴果和1年生植株莖段作為外植體，研究 MS培養基中添加不同濃度激素對鐵皮石斛種子和莖段誘導、增殖以及生根的影響，同時比較了傳統玻璃蘭花瓶與聚丙烯透明薄膜袋在鐵皮石斛工廠化生產上的成本投入。[結果]適合鐵皮石斛誘導的培養基為 MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠；適合增殖的培養基為 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠；適合生根的培養基為1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠。對于工廠化生產而言，選用蒴果作為外植體具有利于無菌體系建立、增殖倍數多和苗長勢整齊一致等優點，聚丙烯透明薄膜袋可以代替傳統的玻璃蘭花瓶。[結論]該研究可為減少鐵皮石斛組培苗的生產成本、縮短生長周期、獲得大量優質組培苗提供一定的理論依據。

關鍵詞 鐵皮石斛； 組織培養； 激素；種子；莖段；聚丙烯透明薄膜袋

中圖分類號 S503.53 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0138-04

Comparison of Tissue Culture and Rapid Propagation Techniques of Different Explants in Dendrobium officinale

RAO Bao-rong1，2， CHEN Yong-he1，2*， JIANG Wen-qing2 et al

（1.Nanping Huake Biotechnology Co.， Ltd.， Jianyang，Fujian 354200；2.Nanping Institute of Agricultural Sciences，Jianyang，Fujian 354200）

Abstract [Objective]To select the best method for propagation of Dendrobium officinale.[Method]This experiment used mature capsule and annual stem segments of D.officinale as explants. The paper studied the effects of MS medium supplemented with different concentration hormones on induction， multiplication and rooting of seeds and stem segment. The paper also compared the cost of traditional vase and transparent polypropylene film bags on factory production. [Result]The appropriate medium for the induction of D. officinale was MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L banana+35 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan， the appropriate medium for the proliferation was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L banana+35 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan， the appropriate medium for rooting was 1/2MS+0.80 mg/LNAA+120 g/L banana+20 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan. The paper also showed that using capsule as explants was in favor of establishing the sterile system， multiplication times and consistent seedlings. Transparent polypropylene film bags can replace traditional vase.[Conclusion] The study provides certain theoretical basis for reducing production cost of D. officinale tissue culture seedling， shortening the growth period and getting a lot of high-quality tissue culture seedling.

Key words Dendrobium officinale；Tissue culture；Hormones；Seeds；Stem segments；Transparent polypropylene film bags

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又稱黑節草，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，含有多糖、生物堿、氨基酸、菲類化合物等大量有益于人體健康的藥用活性成分，具有抗腫瘤、抗凝血、降血脂、降血壓、提高免疫力、抗衰老等功效[1-2]，是一種名貴珍稀中藥材，在《神農本草經》和《本草綱目》 中均被列為上品，被譽為“中華九大仙草之首”，被錄入2015版《藥典》。其主要分布于我國的浙江、云南、廣東、廣西、福建、湖南等省（區）以及澳大利亞、東南亞等國家（地區）。

鐵皮石斛對生長條件要求十分苛刻，自然產量極為稀少，加上長期過度采挖，造成野生資源瀕臨滅絕，而利用組織培養技術可以有效擴大鐵皮石斛的種植規模[3]。雖然目前關于鐵皮石斛的組織培養研究已經有相關報道，但是鐵皮石斛試管苗生長周期長、生長整齊度不一、組織培養所需的成本過高等問題是制約其產業化和規模化生產的瓶頸。筆者采取不同外植體，對不同階段的培養基配方進行篩選，同時對不同接種容器的生產技術及其工藝進行研究，探討組培快繁過程中不同因素對鐵皮石斛生長發育的影響，以期獲得適宜的組培快繁條件，為減少組培苗生產成本、縮短生長周期、獲得大量優質的組培苗提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2014 年在南平市華科生物科技有限公司進行。試驗材料為鐵皮石斛成熟蒴果、1年生鐵皮石斛植株莖段、不透水耐高溫高壓的聚丙烯透明薄膜袋與普通螺口玻璃蘭花瓶。

1.2 方法

1.2.1 無菌系建立。取鐵皮石斛成熟蒴果，在流水下沖洗60 min，用洗衣粉液浸泡20 min，繼續用流水沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，放在無菌瓶中用0.1%的HgCl2消毒8 min后，無菌水沖洗6次，濾紙吸干外表水分，放入無菌盤子上用刀片將其剝開，將種子播在無菌誘導培養基表面。約10 d后，看到原來的黃色粉末狀種子未被感染且開始轉為綠色小原球莖，即以播種方式建立無菌系（圖1）。

從1年生鐵皮石斛植株上選擇生長健壯的莖段，摘去葉片和膜質葉鞘，在流水下沖洗60 min，用洗衣粉液浸泡20 min，繼續用流水沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，放在無菌瓶中用0.1%的HgCl2消毒10 min后，再用無菌水沖洗6次，濾紙吸干水分，放入無菌盤子上，剪去頭尾兩端0.2 mm后，再剪成約1.0 cm長、帶節的小段，插入備好的無菌誘導培養基中，每瓶培養基插4～6個節。約7 d后發現，莖節未被殺死，節上有凸起，培養基表面無感染，即以莖段為外植體的無菌系建立（圖2）。

1.2.2 培養基設計。

以MS為基本培養基，在鐵皮石斛莖段叢生芽的誘導增殖基本培養基研究中，張書萍等均認為MS培養基優于供試的其他培養基[4-5]。根據試驗目的，如誘導（表1）、增殖（表2）、生根（表3）等添加不同濃度的 6-BA

（6-芐基腺嘌呤）[6]，NAA（萘乙酸）[7]和有機添加物，附加蔗糖35 g/L（生根培養基中為20 g/L）、卡拉膠 7.0 g/L，pH 5.8（用1 mol/L NaOH或HCl調節pH）。滅菌條件：121 ℃、131 kPa滅菌20 min。培養基制備好后，置于無菌操作室中，放置72 h，打開紫外燈對無菌操作室進行滅菌。

1.2.3 容器成本比較。

在傳統玻璃蘭花瓶和不透水耐高溫高壓的聚丙烯透明薄膜袋內裝入等比例生根培養基，增殖苗高約2 cm，單株接入2種容器的培養基中，瓶苗每瓶18株，袋苗每袋14株。重復3次，定期觀察記錄，90 d時進行生長勢對比及成本比較，總成本=（容器成本+培養基成本+清洗容器成本）×（1+污染率）。

1.2.4 培養條件。

材料接種后，在1 800 lx 光照下培養，光照時間11 h/d，溫度（25±1） ℃。

2 結果與分析

2.1 不同外植體誘導培養及無菌系建立情況比較

從表4可以看出，試驗所設計使用的培養基都能將種子及莖段外植體誘導出芽，誘導率在80%以上，其中以添加1.0 mg/L 6-BA，120 g/L香蕉的組合為好。各培養基中種子誘導出無菌苗的時間為20～35 d，而莖段誘導出無菌苗的時間為8～15 d；種子誘導率為80%～92%，莖段誘導率為86%～94%。2種外植體的誘導發生途徑不同，種子外植體需經過種子胚萌發—愈傷組織誘導—原球莖誘導—原球莖分化—發芽等過程，而莖段外植體自植入培養基中10 d后，其莖節部芽體就出現凸起，并產生叢生芽簇，生長較快，芽體粗壯，30 d后能生成健壯完整的芽體，不需要經歷原球莖誘導階段[8]。單從少量成苗的生長周期及保持性狀方面來看，莖段外植體培養的時間短，莖段外植體優于種子外植體。但是從無菌系建立效率而言，種子外植體明顯優于莖段外植體，種子誘導感染率8%～13%，而莖段誘導感染率為48%～62%。從生長整齊度來看，也是種子外植體優于莖段外植體。鐵皮石斛誘導培養基以MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠較好。

2.2 不同外植體建立的繁育體系增殖培養情況比較

以莖段為外植體的繁育途徑相對簡單，即莖段—叢生芽—完整植株3個階段，成苗周期短，平均增殖系數小，僅1.2～3.7，短期代數就可以直接用于生根，但是苗生長不整齊，從節上或基部陸續冒出小芽，生長不一（圖3）。而種子前期誘導較慢，一旦進入原球莖開始分化階段，發芽后增殖系數較大，為5.3～7.8，葉濃綠，苗木生長整齊（圖4），經過幾代的轉接瓶內苗數量減少，苗逐漸變壯。從工廠化生產上看，種子繁育可在一定時間內獲得大量的成苗。在增殖培養基中添加適量的香蕉效果好，增殖系數高，無菌苗生長正常，不出現莖粗短、玻璃化、黃化及水漬狀等情況，莖節間長而粗壯。試驗結果表明，香蕉的添加量以120 g/L為宜。綜合各因素可知，種子繁育可為鐵皮石斛工廠化生產提供更好的基礎。從表5可以看出，在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠培養基中進行鐵皮石斛增殖培養較為適宜。

2.3 生根培養情況比較

NAA濃度在一定程度上影響著組培苗的生根時間、根系數量和瓶苗生長情況等。從表6可以看出，根的生長勢隨著NAA濃度的增加而逐漸遞增，平均生根系數為1.25～4.12，生根率也逐漸遞增。該試驗結果表明，在1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠培養基中進行生根培養較為適宜。

2.4 接種容器的成本比較 由圖5、6和表7可知，鐵皮石斛在蘭花瓶內與在聚丙烯透明薄膜袋內的長勢沒有明顯差異，生長周期也沒有顯著性差異。雖然聚丙烯透明薄膜袋中鐵皮石斛苗的感染率高于傳統蘭花瓶，但是總成本只是傳統蘭花瓶中的1/2（表8）。主要體現在一次性聚丙烯透明薄膜袋的成本較玻璃瓶成本低，而且采用一次性聚丙烯透明薄膜袋可節省人工成本等。采用一次性聚丙烯透明薄膜袋

對后期的出苗也十分有利，蘭花瓶出苗需用鑷子將苗從窄口瓶取出，這對苗的根、莖、葉都有一定量的損傷，且容易污染，而一次性聚丙烯透明薄膜袋育苗時只要將袋口完全剪開就可以保持完好的植株，有效提高了后期移栽的成活率。

3 結論與討論

試驗初步建立了一套較完整的鐵皮石斛組培快繁體系。組織培養獲得鐵皮石斛再生植株的途徑有很多種，用成熟的蒴果消毒后進行無菌播種形成原球莖，并經過增殖分化發育成完整植株是其中一種，也可以選擇適宜的外植體（莖段、莖尖、幼芽、葉片等）誘導形成擬原球莖或者叢生芽來實現快速繁殖，可解決鐵皮石斛資源緊缺問題。組織培養主要受培養基和培養條件等因素的共同影響，其中激素種類和濃度是至關重要的[9-10]。試驗分別用種子和莖段作為外植體，研究了不同基本培養基、激素配比、有機添加物對鐵皮石斛種子萌發、原球莖增殖、分化和生根壯苗的影響，并對莖段發芽、生根壯苗長勢和時間進行了比較，篩選出適合各個培養階段的培養基配方。在鐵皮石斛的組織培養中，生長調節劑對各階段的生長分化促進作用明顯，該試驗與唐桂香等[11]的研究相似。從工廠化生產育苗角度來看，苗的整齊度以及一定時間內生產大量的瓶苗，種子擴繁優于莖段，主要體現在起步階段的種子外植體感染率有效降低，種子的增殖倍數高于莖段。加上鐵皮石斛的種子數量極多，快速繁殖可利用這一優勢，利用種子進行非共生萌發，進而不斷地分化和增殖，產生種苗，因此這一途徑是種苗工廠化生產的重要途徑[12]。種子萌發適宜的誘導培養基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠；增殖培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠；生根培養基為1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠。

鐵皮石斛在蘭花瓶內與在聚丙烯透明薄膜袋內的長勢、生長周期方面沒有明顯的差異[13]，但是薄膜袋質地輕，體積小，不易破損，裝箱和搬運方便，便于運輸和推廣，可減少回收和清洗容器的工序，達到省工、省時、省錢的目的，同時也給鐵皮石斛種植者帶來極大的方便，洗苗時對苗的損傷極小。袋培苗在降低生產成本、提高生產效率上有顯著優勢，完全可以取代瓶培苗，但在操作工序上有一定的要求，在灌裝與高壓時必須保證培養基不得粘在袋口；沒有封口的培養基要及時接種并密閉袋口。袋培苗后期培養與煉苗污染率降低，其主要原因是袋培苗在接種后即用封口機將袋口全部封死，避免了培養過程中的2次污染。 而瓶式培養采用螺旋塑料蓋，難免存有空隙或松動，真菌孢子等易隨空氣進入瓶內造成污染[14]。筆者認為袋式培養在鐵皮石斛組織培養中是切實可行的，可以廣泛推廣應用。

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