低溫脅迫下水稻基因組DNA甲基化的MSAP分析

王亞男 范思靜

摘要 [目的]研究低溫脅迫對(duì)水稻幼苗DNA甲基化水平及模式變化。[方法]以水稻幼苗為材料，利用66個(gè)不同的引物組合對(duì)來(lái)自對(duì)照（CK）、4 ℃低溫脅迫1 d（T1）、4 ℃低溫脅迫2 d（T2）、4 ℃低溫脅迫3 d（T3）和恢復(fù)2 d（T4）的水稻DNA樣品進(jìn)行甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）分析，探討低溫脅迫和恢復(fù)后，DNA的甲基化水平及模式變化。[結(jié)果]甲基化水平分析表明，CK、T1、T2、T3處理樣本中總甲基化率分別為37.19%、33.79%、33.67%和32.67%。進(jìn)一步分析表明低溫脅迫處理導(dǎo)致水稻DNA總甲基化水平降低，然而恢復(fù)處理組（T4）減緩了這種趨勢(shì)。[結(jié)論]水稻基因組部分位點(diǎn)的甲基化可能參與了水稻對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞 低溫脅迫；水稻；甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性；DNA甲基化

中圖分類號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）04-0135-03

MSAP Analysis of Genomic DNA Methylation in Oryza sativa under Low Temperature Stress

WANG Ya-nan ， FAN Si-jing

（Anhui Jinpeiyin Technology Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230088）

Abstract [Objective]Effects of low temperature stress on genomic DNA methylation levels and patterns in Oryza sativa were studied.[Method]In this study， rice seedlings were used as materials to carry out MSAP analysis by using 66 different primer combinations. The experiment included a control group and four treatment groups. T1-T3 were under 4 ℃ for 1-3 days， T4 was the two-days recovery group after low temperature stress. [Result]The methylation levels of CK， T1， T2， T3 treatment were 37.19%， 33.79%， 33.67% and 32.67%， respectively. Further analysis showed that the level of global DNA methylation in O.sativa were decreased under low temperature stress， while normal temperature recovery treatment could alleviate the trend. [Conclusion]Methylation in some loci of rice genome may participate in response of rice to low temperature stress.

Key words Low temperature stress；Oryza sativa；MSAP；DNA methylation

低溫引起的冷應(yīng)力是較常見的環(huán)境壓力之一，它是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的一個(gè)主要因素。按照低溫程度和植物受害情況可分為冷害（零上低溫對(duì)植物的傷害）和凍害（零下低溫對(duì)植物的傷害）兩大類[1]。

為了應(yīng)對(duì)環(huán)境變化，將植物事先暴露于低溫環(huán)境中，使其獲得對(duì)寒冷的耐受性，這涉及細(xì)胞代謝、組織結(jié)構(gòu)的重塑、基因表達(dá)的重新編程。

DNA甲基化是生物界中普遍存在的DNA共價(jià)修飾方式。大量研究表明，DNA甲基化直接參與植物對(duì)干旱、重金屬、低溫等逆境脅迫的響應(yīng)，調(diào)控基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致植物表型發(fā)生變化[2-4]。DNA甲基化已被假設(shè)為植物表型臨時(shí)變化的潛在機(jī)制之一。

目前，研究植物基因組中的DNA甲基化方法主要有甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)、亞硫酸鹽測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法和高分辨率熔解曲線法。甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)是采用限制性內(nèi)切酶Hpa II和Msp I識(shí)別DNA序列中的5′-CCGG位點(diǎn)進(jìn)行酶切，然后對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行接頭的連接，再對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增片段多態(tài)性分析。由于其操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高，已廣泛應(yīng)用于多種植物DNA甲基化的研究[5-9]。

水稻是喜溫作物，在其整個(gè)生長(zhǎng)歷程中，尤其是幼苗階段，由于季節(jié)原因，經(jīng)常遭遇低溫冷害。低溫脅迫給水稻生產(chǎn)造成巨大的損失，導(dǎo)致稻種萌發(fā)率低，幼苗生長(zhǎng)遲緩，甚至死亡。該研究以中秈兩系雜交稻品種兩優(yōu)9526幼苗為材料，利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)研究低溫脅迫及恢復(fù)過(guò)程中兩優(yōu)9526幼苗DNA甲基化水平以及模式的變化，為深入了解水稻對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理方法

試驗(yàn)以中秈兩系雜交稻品種兩優(yōu)9526為材料。篩選飽滿的種子進(jìn)行發(fā)芽，然后盆栽，待水稻出苗后，進(jìn)行正常培養(yǎng)，光照100 μmol/（m2·s），光周期14 h/10 h（L/D），溫度（28±2）℃。待幼苗第4片葉長(zhǎng)出，倒三葉完全伸展時(shí)，取生長(zhǎng)一致的幼苗進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。以正常處理為對(duì)照（CK）；4 ℃低溫處理1 d為T1處理；4 ℃低溫連續(xù)處理2 d為T2處理；4 ℃低溫連續(xù)處理3 d為T3處理；4 ℃低溫連續(xù)處理3 d后，恢復(fù)2 d為T4處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，取葉片用液氮冷凍，–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

水稻葉片總DNA提取參照改良CTAB法[9]，DNA純度采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，同時(shí)利用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定230、260 nm處的OD值，將純度較高的DNA放置在冰箱中保存，以備后續(xù)的酶切與PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.3 DNA甲基化多態(tài)性分析

采用雙酶切組合EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ和EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ?qū)NA進(jìn)行酶切，具體試驗(yàn)操作參照Xiong等[10]的方法。酶切后的DNA采用接頭進(jìn)行連接，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，連接的接頭與PCR擴(kuò)增引物在表1中列出。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后采用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后的顯影參照Sanguinetti法[11]采用銀染顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)兩優(yōu)9526幼苗DNA甲基化水平的影響

從圖1可看出，經(jīng)酶切、PCR反應(yīng)擴(kuò)增后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，共檢測(cè)出3個(gè)甲基化類型，Ⅰ型為無(wú)甲基化或單鏈內(nèi)甲基化，電泳結(jié)果為都有帶；Ⅱ型為單鏈外甲基化，Hpa Ⅱ酶切位點(diǎn)有帶，Msp Ⅰ酶切位點(diǎn)無(wú)帶；Ⅲ型為雙鏈內(nèi)甲基化，Hpa Ⅱ酶切位點(diǎn)無(wú)帶，Msp Ⅰ酶切位點(diǎn)有帶。

為了檢測(cè)水稻幼苗在響應(yīng)低溫脅迫及恢復(fù)過(guò)程中的DNA甲基化水平變化，利用66個(gè)不同的引物組合（表1）對(duì)來(lái)自對(duì)照（CK）、低溫脅迫1 d（T1）、低溫脅迫2 d（T2）、低溫脅迫3 d（T3）和恢復(fù)2 d（T4）處理組的水稻幼苗DNA樣品進(jìn)行MSAP分析。CK、T1、T2、T3、T4處理組DNA甲基化圖譜中總擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)分別為1 835、1 808、1 806、1 812和1 830（表2）。從低溫脅迫處理前后甲基化率 [（Ⅱ + Ⅲ）/（Ⅰ + Ⅱ + Ⅲ）×100%]和全甲基化率[Ⅲ/ （Ⅰ+ Ⅱ + Ⅲ）× 100%]的變化來(lái)看，低溫處理導(dǎo)致水稻幼苗DNA總甲基化水平、全甲基化水平降低；而恢復(fù)處理組（T4）減緩了這種趨勢(shì)，DNA總甲基化、全甲基化水平均有所回升。

2.2 低溫脅迫過(guò)程中兩優(yōu)9526幼苗DNA甲基化模式的變化

經(jīng)低溫處理后，水稻幼苗DNA甲基化的變化主要分為3類，共包括13種帶型，其中A類帶型（A1～A3）是表示單態(tài)性的甲基化位點(diǎn)，即對(duì)照與處理間的甲基化位點(diǎn)一致、無(wú)變化；B類帶型（B1～B5）是指發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)，與對(duì)照相比，經(jīng)低溫處理后，原先甲基化的位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化，甲基化位點(diǎn)數(shù)有所減少；C類帶型（C1～C5）是指未甲基化或單鏈外甲基化的位點(diǎn)發(fā)生了超甲基化，即與對(duì)照相比，原先甲基化或單鏈外甲基化的位點(diǎn)經(jīng)低溫處理后發(fā)生了超甲基化，甲基化的總位點(diǎn)數(shù)有所增加。從表3可以看出，與對(duì)照相比，隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，水稻幼苗基因組中發(fā)生DNA甲基化的位點(diǎn)數(shù)逐漸降低，而恢復(fù)處理改變了這種趨勢(shì)。由此可見，低溫脅迫主要誘導(dǎo)植株發(fā)生較高比例的去甲基化。進(jìn)一步分析低溫造成的DNA甲基化多態(tài)性位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生的超甲基化（C3、C4、C5型）帶型是主要的多態(tài)性帶型（圖2），分別占總甲基化位點(diǎn)數(shù)的7.33%、7.69%、7.40%。

3 討論

DNA甲基化是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，甲基化水平不足或過(guò)高，都會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育不正常和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常[12]。研究表明，非生物脅迫（熱脅迫、重金屬脅迫、鹽脅迫等）對(duì)DNA的甲基化水平會(huì)造成影響[13-15]。Kovarik等[15]的研究表明，鹽和滲透脅迫可誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞的異染色質(zhì)區(qū)發(fā)生超甲基化，而恢復(fù)正常條件后，發(fā)生超甲基化的位點(diǎn)又會(huì)去甲基化，可見，基因組的甲基化、超甲基化可能是植物適應(yīng)非生物脅迫機(jī)制的內(nèi)在反應(yīng)。該試驗(yàn)中，在低溫處理后，利用MSAP分析方法檢測(cè)發(fā)生甲基化和超甲基化的位點(diǎn)，說(shuō)明DNA甲基化反應(yīng)可能參與了水稻對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1] CHINNUSAMY V，ZHU J，ZHU J K.Cold stress regulation of gene expression in plants[J].Trends in plant science，2007，12（10）：444-451.

[2] 黃韞宇，張海軍，邢燕霞，等.NaCl脅迫對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響及DNA甲基化的MSAP分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（8）：1646-1656.

[3] 王鶴潼，何蕾，宋杰，等.改進(jìn)MSAP-PCR技術(shù)應(yīng)用于Cd脅迫下擬南芥DNA甲基化分析[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，34（8）：1618-1624.

[4] 楊震，彭選明，張逸妍，等.植物DNA甲基化及脅迫誘導(dǎo)的變異[J].生物工程學(xué)報(bào)，2016，32（12）：1642-1653.

[5] 何克勤，程曉紊，胡能兵，等.甜葉菊種質(zhì)離體保存后的DNA甲基化研究[J].中藥材，2016（10）：2190-2193.

[6] 趙云雷，葉武威，王俊娟，等.DNA甲基化與植物抗逆性研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（7）：1479-1489.

[7] 潘雅姣，傅彬英，王迪，等.水稻干旱脅迫誘導(dǎo)DNA甲基化時(shí)空變化特征分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（9）：3009-3018.

[8] 陸許可，王德龍，陰祖軍，等.NaCl和Na2CO3對(duì)不同棉花基因組的DNA甲基化影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（16）：3132-3142.

[9] 朱紅菊，劉文革，趙勝杰，等.NaCl脅迫下二倍體和同源四倍體西瓜幼苗DNA甲基化差異分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（20）：4045-4055.

[10] XIONG L Z，XU C G， SAGHAIMAROOF M A，et al.Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines，detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique[J].Mol Gen Genet，1999，261（3）：439-446.

[11] SANGUINETTI C J，DIAS NETO E，SIMPSON A J.Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels[J].Biotechniques，1994，17（5）：914-921.

[12] 李際紅，邢世巖，王聰聰，等.銀杏基因組DNA甲基化修飾位點(diǎn)的MSAP分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2011，38（8）：1429-1436.

[13] PAREEK，A，SOPORY S K，BOHNERT H J，et al.Abiotic Stress Adaptation in Plants：Physiological，Molecular and Genomic Foundation [M].Berlin：Springer Press，2010：231-241.

[14] 文歡，彭成，饒朝龍，等.花葉型與艾葉型烏頭葉片基因組DNA甲基化修飾的MSAP分析[J].中國(guó)中藥雜志，2016，41（19）：3602-3608.

[15] KOVARIK A，KOUKALOVA B，BEZDEK M，et al.Hypermethylation of tobacco heterochromatic loci in response to osmotic stress [J].Theor Appl Genet，1997，95（1）：301-306.