鈍頂螺旋藻酶解條件的優化

謝倩 謝崔越

摘要 以鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）為研究對象，運用蛋白酶SM98011酶解螺旋藻粗蛋白提取液，得到具有抗氧化活性的產物。結果表明，鈍頂螺旋藻酶解的最優條件為加酶量1∶15、酶解溫度50 ℃，酶解時間5 h。在此條件下，螺旋藻酶解產物的清除自由基能力為33.28%。

關鍵詞 鈍頂螺旋藻；酶解；清除自由基能力

中圖分類號 S986 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0011-02

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for Spirulina platensis

XIE Qian1，XIE Cui-yue2 （1.Liaocheng No.1 High School，Liaocheng，Shandong 252000；2.Luxi Quality Inspection Center of Liaocheng Bureau of Quality and Technical Supervision，Liaocheng，Shandong 252000）

Abstract Taking Spirulina platensis as research object，crude protein extract was hydrolyzed with protease SM98011 to obtain antioxidant substances.The results showed that the optimum conditions for enzymatic hydrolysis of Spriulina platensis were as follows：the addition quantity of 1∶15，enzymatic hydrolysis at 50 ℃ for 5 h.Under these conditions，the scavenging capability of enzymatic hydrolysate of Spirulina platensis to free radicals was 33.28%.

Key words Spirulina platensis；Enzymatic hydrolysis；Scavenging capability to free radicals

近年來，抗衰老研究已成為研究熱點之一[1]。研究表明，增加蔬菜與水果的攝入量可以提高對一些癌癥的抵抗力，主要是因為其富含清除自由基的物質[2-4]。據報道，一些藻類可以阻止或預防自由基與活性氧造成的機體損傷，阻止癌細胞形成以及其他損害的發生[5]。此外，有學者從海洋藻類中提取出具有抗氧化和抗癌功能的多糖[6]。Hu等[7]研究表明，從黑角菜屬的海藻和昆布屬等植物中提取的硫酸鹽多糖具有較高的清除自由基活性。從紅藻門植物中提取的金屬卟啉類物質可以通過增加小鼠體內抗氧化酶的含量，來消除脂質過氧化作用，從而達到延緩衰老的目的[8]。

藻類產品是一種均衡、無害、自然的產品，被廣泛應用于食品以及生命科學研究中[9-10]。海洋藻類品種的多樣性為新藥品的研究提供了多種原料[11-12]。海洋中存在大量的蛋白質資源，但很少有關于藻類水解蛋白的應用報道[13-15]。海洋資源具有廣闊的發展空間，關于新的海洋產品復合物在未來的醫學研究中具有很大的潛力[16]。目前，有多種從藻類中提取生物活性物質的方法，而水解法具有其他方法所不可比擬的優點，不需要任何有毒的化學藥品。酶解提取出的物質比水提和有機溶劑提取的物質具有更高的活性[17]。

螺旋藻具有特殊的細胞壁結構，因其細胞形態呈螺旋狀而得名，易于水解，目前已有許多關于螺旋藻酶解反應的報道。螺旋藻中含有極為豐富的營養元素，甚至比日常食用的植物類和動物類食品的營養更加豐富，可作為地球上豐富的營養源。螺旋藻除了可作為營養豐富的食品外，在螺旋藻的水解產物中還提取出具有降血壓、抗艾滋、抗氧化等的活性物質，可增強機體抵抗力，在一定程度上替代合成藥品，用于治療人類多種疾病。筆者運用山東大學生命科學學院微生物實驗室發現并保存的Bacillus sp.SM98011菌株發酵產生的蛋白酶酶解鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），探討鈍頂螺旋藻酶解的優化條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和菌株

1.1.1 試驗材料。

鈍頂螺旋藻由山東大學生命科學學院微生物實驗室培養，將螺旋藻藻液按約1∶1的比例與培養基混合，放入5 000 mL玻璃瓶中置于光照培養箱中，白熾燈照明，每天通氣約12 h，溫度控制在28 ℃左右。培養7～8 d后對處于對數生長期的成熟螺旋藻進行收集。此外，也可不對螺旋藻培養基通氣，培養21～28 d后對成熟螺旋藻進行收集。清洗后，于-20 ℃下保存。

1.1.2 試驗菌株。

試驗菌株為山東大學生命科學學院微生物實驗室收藏菌株Bacillus sp.SM98011，經發酵后產蛋白酶，經測定其催化活力為4 000 U/ mL，可用于酶解反應[18]。

1.2 試劑與藥品

α-脫氧核糖（Sigma公司）；FeSO4·7H2O、NaHCO3、K2HPO4、NaCl、CaCl2·2H2O、H2O2、NaH2CO3、Na2HCO3、硫代巴比妥酸、三氯乙酸等均為國產分析純。

1.3 儀器 高速冷凍離心機，由Epppendorff公司生產；722分光光度計，由上海精密科學儀器有限公司生產；分光光度計GeneQuant100，由美國GE公司生產；多用途水浴恒溫振蕩器DSHZ-3000，由上海亞榮生化儀器廠生產。

1.4 方法

1.4.1 鈍頂螺旋藻的養殖。

螺旋藻培養基采用Zarrouk培養基配方配制：NaHCO3 16.80 g/L、K2HPO4 0.50 g/L、NaNO3 2.50 g/L、NaCl 1.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、K2SO4 1.00 g/L、CaCl2·2H2O 0.04 g/L、EDTA 0.08 g/L。將鈍頂螺旋藻藻種接種至培養基，置于光照培養箱中，每天通氣12 h，用白熾燈照光，溫度控制在（28±2）℃。培養7～8 d，于對數生長期進行螺旋藻收集。收集螺旋藻后，用流動的蒸餾水清洗干凈，于-20 ℃下保存，備用。

1.4.2 鈍頂螺旋藻粗蛋白的提取。

螺旋藻收集后，與濃度20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）混合并稀釋至適當濃度，反復凍融，以利于蛋白質的釋放。將蛋白液于4 ℃下11 000 r/min離心20 min，上清液即為螺旋藻粗蛋白液，于4 ℃下保存，備用。

1.4.3 蛋白酶 SM98011的培養。斜面培養基：蛋白胨1.00%，酵母粉0.30%，葡萄糖1.00%，瓊脂1.60%，pH 7.2～7.5。液體發酵產酶培養基：玉米粉2.00%，麩皮1.00%，豆粕2.00%，NaHPO4 0.10%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.10%，Na2CO3 0.10%，pH 7.5，裝液量50 mL/500 mL三角瓶[19]。

蛋白酶SM98011的制備：將Bacillius sp.SM98011接種于液體發酵產酶培養基，在32 ℃、120 r/min條件下培養約36 h，確保通氣量。將產酶發酵液在4 ℃、11 000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃下保存，備用。

1.4.4 藻蛋白酶解條件的優化。

將凍融后經過離心的螺旋藻粗蛋白各取45 mL裝入500 mL三角瓶中，按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的比例分別加入20 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液（設為酶解對照）以及SM98011蛋白酶液，混勻后置于50 ℃水浴搖床中，設轉速為90 r/min，分別混勻酶解，于酶解2、3、4、5、6 h后分別取樣，迅速將樣品置于90 ℃水浴鍋中，保溫10～15 min，使酶滅活。將酶解產物在4 ℃、11 000 r/min離心20 min，得到的上清液即為酶解液，棄去大顆粒沉淀，收集上清液，于-20 ℃下保存，備用。

1.4.5 清除羥基自由基能力的測定。采用α-脫氧核糖法[20-21]測定不同酶解時間鈍頂螺旋藻的清除自由基能力。

將FeSO4制成母液，同時將EDTA制成高濃度母液，將二者混合成濃度10 mmol/L的FeSO4-EDTA，并加入少量的還原鐵粉，以防止FeSO4被氧化。取0.2 mL的10 mmol/L FeSO4-EDTA溶液置于具塞試管中，加入0.2 mL的α-脫氧核糖溶液（濃度20 mmol/L），然后加入0.2 mL測試樣品（不同時間的酶解液樣品、未酶解樣品），用pH 7.4、20 mmol/L磷酸緩沖液將溶液定容至1.8 mL，再加入0.2 mL的H2O2（10 mmol/L），混勻，將各試管置于37 ℃水浴鍋中保溫1 h。然后，在各試管內加入1.0 mL 2.8%三氯乙酸溶液終止反應，再加入1.0 mL 1%的硫代巴比妥酸溶液，將溶液混勻后在沸水浴中加熱10 min后顯色，將溶液自然冷卻后（1 h內）于532 nm處測定吸光值（As）。不加樣品，以緩沖液或三蒸水代替測試樣品，作為對照，進行相同操作處理，測定其對比吸光值（Ac）。

按照以下公式計算樣品的自由基清除能力（SA，單位%）：SA=（Ac-As）/ Ac×100%。

2 結果與分析

蛋白酶SM98011是由山東大學生命科學學院微生物實驗室提取發現的，并多次加以利用，在以前的報道中應用SM98011發酵產蛋白酶的適宜酶解溫度約為50 ℃，其酶解樣品時反應溫度在50 ℃左右[18，22]，所以選取50 ℃作為該試驗中酶解溫度。運用α-脫氧核糖法測定不同酶解時間鈍頂螺旋藻的抗氧化活性，結果發現不同加酶量及不同酶解時間鈍頂螺旋藻的清除自由基能力比未經酶解的對照樣品強，而當加酶量為1∶15時，酶解5 h的酶解液與其他樣品相比表現出更高的抗氧化活性，約為33.28%（圖1）。由此可見，鈍頂螺旋藻的最優酶解條件為：酶解溫度50 ℃，蛋白酶SM98011的加酶量為1∶15，酶解時間5 h。

3 討論

螺旋藻是研究較多的一種高價值藻類，研究報道主要集中在其降血壓活性以及其作為自然食品所具有的豐富營養，而關于從螺旋藻粗蛋白的酶解液中提取抗氧化活性物質的報道較少。筆者對鈍頂螺旋藻粗蛋白酶解液的清除自由基能力進行了測定。

鈍頂螺旋藻經多次凍融提取粗蛋白后，用蛋白酶SM98011對其進行酶解。據報道，運用SM98011發酵產的蛋白酶酶解樣品時所用的反應溫度在50 ℃左右[18，22]，因此該試驗中用50 ℃作為酶解反應溫度，將螺旋藻在酶解時間分別設為2、3、4、5、6 h，采用α-脫氧核糖法檢測其抗氧化活性。結果發現，酶解2～6 h鈍頂螺旋藻的清除自由基能力呈現上升趨勢，分別為20.9%、23.5%、27.8%、33.2%、28.7%，均高于未酶解樣品。由此可見，酶解有利于促進螺旋藻樣品中具有抗氧化活性物質的釋放。隨著酶解時間的延長，鈍頂螺旋藻的清除自由基能力呈現先遞增后減小的趨勢，因此，確定鈍頂螺旋藻的適宜酶解時間對螺旋藻中抗氧化物質的提取具有較大的影響。

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