進境百合種球中鐮刀菌的分離鑒定

李敏 宋蘊哲 虞赟 陳智明 劉國坤 沈建國

摘要 [目的]從日本進境百合種球中發現帶有褐色、不規則病斑的種球，對其進行病原菌分離培養，以明確其病原種類及分類地位。[方法]通過菌落形態特征觀察、ITS序列分析、致病性測定對該分離物進行鑒定。[結果]該分離物接種百合種苗引起枯萎反應，ITS序列和層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）的序列相似性為100%，結合分離物的菌落特征和孢子特征將病原菌鑒定為層出鐮刀菌。[結論]引起百合種球病斑的病原菌為層出鐮刀菌。

關鍵詞 百合；種球；層出鐮刀菌；鑒定

中圖分類號 S41；S436.8 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0008-03

Identification of Fusarium proliferatum in Introduced Lily Bulbs

LI Min1， SONG Yun-zhe2， YU Yun1， SHEN Jian-guo1* et al

（1.Inspection and Quarantine Technology Center， Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fuzhou， Fujian 350000；2.College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forest University， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract [Objective] The pathogene was isolated and cultured from the lily bulbs introduced from Japan which had brown and irregular disease spot， so as to determine its taxonomic status. [Method] The pathogene were identified by pathogenicity determination，morphology observation and ITS sequence analysis. [Result] The ITS sequence of the pathogen causing wilt in lily identity of 100% with Fusarium proliferatum published in GenBank. [Conclusion] The results indicated that the pathogene isolated from the lily bulbs with black brown and irregular disease spot were F. proliferatum.

Key words Lily；Bulbs；F. proliferatum；Identify

鐮刀菌可引起百合枯萎病，是影響百合生產的重要病害之一[1]。該病原菌主要侵染百合肉質根或鱗莖盤基部，引起肉質根和盤基變褐腐爛，并可向上發展導致鱗片出現褐色凹陷病斑，后期鱗片從盤基散開并剝落。罹病鱗莖的植株明顯矮化，葉片由上而下黃化，最后枯萎而死[2]。2016年福建出入境檢驗檢疫局從日本進境的百合種球中發現帶有褐色、不規則病斑的種球，對其進行病原菌分離培養，利用菌落形態特征觀察、ITS序列分析、致病性測定對該分離物進行了鑒定，旨在為百合枯萎病的研究與防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為日本進境百合種球，進境時間為2016年3月。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離。

選取有病斑的感病種球進行病原菌分離。種球病斑部位用70%乙醇表面消毒，切取病健交界處的組織，置入5% NaClO消毒3 min，無菌水漂洗3次后，將組織切成小塊接種于PDA培養基平板上，25 ℃培養。取菌落邊緣的菌絲進行純化3次后用于后續試驗。

1.2.2 致病性測試。

將培養基上的分離物用滅菌水稀釋后制成懸浮液，以孢子懸浮液作為接種體，采用灌根接種法接種百合幼苗植株。接種后用塑料袋罩好，置于25 ℃生化培養中保濕48 h。去掉塑料袋，將植株移至溫室正常生長，以滅菌水為對照，觀察植株的發病情況。

1.2.3 形態學鑒定。

觀察菌落在PDA培養基上的顏色和形態，在光學顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子梗、分生孢子、分生孢子器的形狀和顏色，測量其大小，并顯微拍攝。根據病原菌的形態特征，進行病原菌種類的鑒定，以明確病原菌的分類地位。

1.2.4 分子生物學方法鑒定。

1.2.4.1 總DNA提取。

將PDA培養基上的菌絲挑至1.5 mL分離管中，采用植物基因組提取試劑盒（TIANGEN公司，DP305-02）提取病原菌總DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.4.2 ITS區PCR擴增。

采用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）/ ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進行PCR擴增，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

擴增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補至25.0 μL。反應循環程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃ 延伸10 min。

取10.0 μL擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中電泳，核酸染料染色后用凝膠成像系統分析。擴增產物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，所得序列經Contig軟件進行正反向拼接、人工校對后提交到NCBI數據庫進行Blast，與GenBank中的核酸序列進行比對與同源性分析，確定菌株類別。

2 結果與分析

2.1 菌落形態特征

從百合種球的褐色、不規則病斑中分離出1株分離物（圖1），編號為bh-1，PDA培養基上菌落白色，圓形，菌絲疏松如絮狀，基底粉色，略帶紫色（圖2）。分生孢子梗瓶頸狀（圖3）。小型分生孢子較多，卵圓形至長圓形，有0～1個分隔，大小為（4.7～12.1） μm×（1.4～3.9） μm，著生于分生孢子梗上，常在瓶梗頂端聚成球團；大型分生孢子較少，紡錘形或鐮刀形，較粗壯，稍彎曲，有3～5個分隔，大小為（17.3～ 40.7） μm×（2.1～4.8） μm（圖4）。

2.2 致病性測試

將孢子懸浮液接種到健康百合幼苗植株上，7 d后葉片頂部黃化，隨后葉片由上而下黃化、萎蔫，15 d后枯萎而死。從接種發病的病株上分離獲得一致的病原菌，無菌水對照植株未出現癥狀（圖5）。

2.3 序列分析

利用真菌通用引物ITS/I4TS5對分離物bh-1提取的DNA進行擴增，PCP擴增產物雙向測序后拼接得到557 bp的序列（圖6）。將該序列提交到NCBI上進行Blast比對，分離物bh-1與GenBank中Fusarium proliferatum（登錄號：KJ767073、EU151484、FJ040179）的ITS區序列同源性均達100%。結合菌落、分生孢子、培養性狀等形態學特征和ITS區的DNA序列分析，確定分離物bh-1為層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）。

3 結論與討論

近年來，隨著物質文化生活水平的不斷提高，人們對各種苗木、花卉和盆栽等景觀植物的需求不斷增長，越來越多的游客在進境或郵寄包裹時攜帶花卉種子、種球及植株等。鐮刀菌屬是進境水果、種苗等植物產品中經常截獲的有害生物，而長期以來該屬病原菌的命名較混亂，加之其病原菌種類較多，傳統的形態學鑒定方法為真菌分類研究提供了必要前提，但存在外界因素和人為因素的局限性，尤其分離培養物的培養性狀不典型或者不產孢時，為該菌的口岸檢疫鑒定工作增加了一定困難。

鐮刀菌屬真菌可侵染農作物、觀賞植物等100余種，引起植物根腐、莖腐、穗腐等多種病害，導致植物萎蔫死亡[3]。層出鐮刀菌又稱層生鐮刀菌或再育鐮刀菌，該菌寄主廣泛，可侵染玉米、向日葵、大蒜、瓜類等多種作物及觀賞植物[4-7]。國內對百合病害的研究中少有報道該菌，前人報道了云南百合、龍牙百合、甘肅百合、江西百合枯萎病的主要致病菌均為尖孢鐮刀菌[1，8-10]；李誠等[11]報道蘭州百合枯萎病病原為尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌（F.rnoniliforme）和茄腐皮鐮刀菌（F.solani）。在國外研究中，Prados-ligero等[12]報道了 Fusarium proliferatum引起西班牙百合枯萎病。該研究采用真菌利用ITS通用引物，擴增百合種球中分離物bh-1的DNA，擴增產物進行測序，所得序列與GenBank中的核酸序列進行比對，初步確定病原菌種類，結合菌落、分生孢子、培養性狀等形態學特征，查閱相關文獻資料，確定分離物bh-1為層出鐮刀菌（F.proliferatum），這與Prados-ligero等[12]的研究結論一致。該研究將傳統的形態學鑒定和分子生物學技術相結合，可以快速地對層出鐮刀菌進行鑒定，兼顧鑒定檢疫的效率和質量，為層出鐮刀菌的鑒定和進境口岸檢疫提供理論依據。

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