CTNNB1基因沉默后卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究

陳方旭 劉海艷(通訊作者) 劉建偉

121001錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

CTNNB1基因沉默后卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究

陳方旭 劉海艷(通訊作者) 劉建偉

121001錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

目的：探討CTNNB1沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。方法：用人類卵巢癌SKOV3細(xì)胞于體外培養(yǎng)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和CTN實(shí)驗(yàn)組，然后轉(zhuǎn)染入靶向CTNNB1的shRNA載體質(zhì)粒。通過Westernblot及MMT的方法檢測(cè)CTNNB1的蛋白表達(dá)及細(xì)胞的活力。結(jié)果：以CTNNB1為靶向的shRNA能下調(diào)CTNNB1蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染CTNNB1的shRNA后，CTN組的細(xì)胞生長(zhǎng)活性與增殖受到了明顯的抑制(P＜0.05)。結(jié)論：CTNNB1基因的表達(dá)下調(diào)可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖。

卵巢癌；CTNNB1；ShRNA

卵巢癌在婦科腫瘤中發(fā)病率占第3位，但其死亡率位居首位，70%以上的患者首次發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，預(yù)后不良[1]。近年來研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變異可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，并且可誘導(dǎo)腫瘤免疫耐受[2]。CTNNB1是β-catenin的編碼基因，前期研究提示CTNNB1蛋白在卵巢癌組織中異常高表達(dá)，并且可能與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]。本研究旨在進(jìn)一步探討CTNNB1在卵巢癌細(xì)胞增殖中的作用。

資料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：①ShRNA的設(shè)計(jì)和質(zhì)粒構(gòu)建：CTNNB1siRNA序列：正義鏈5'-AACAGTCTTACCTGGACTCTG-3'，以人和小鼠的基因無同源性的序列作為陰性對(duì)照，并整合到含有RNA聚合酶IIIU6增強(qiáng)子的質(zhì)粒。將含靶向CTNNB1序列的質(zhì)粒命名為p-CTN，對(duì)照組的質(zhì)粒則為p-NEG。②細(xì)胞及培養(yǎng)：人卵巢上皮漿液性癌細(xì)胞系SKOV3置于完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，于37℃、飽和濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每2～3 d傳1代。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。③主要試劑：LipofectamineTM2000；cDNA合成試劑盒，CTNNB1抗體，化學(xué)發(fā)光試劑盒ECLTestKit，甲基噻唑基四唑MMT，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)儀，PI，流式細(xì)胞儀。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：利用Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞隨機(jī)分3組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和CTN實(shí)驗(yàn)組。陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染p-NEG質(zhì)粒；CTN組轉(zhuǎn)染p-CTN質(zhì)粒；于轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，更換培養(yǎng)基為正常培養(yǎng)基(含10%FBS和抗生素的)，培養(yǎng)72 h。

蛋白質(zhì)印記法：轉(zhuǎn)染48 h后獲取細(xì)胞。超聲裂碎細(xì)胞，測(cè)定每次裂解的蛋白質(zhì)產(chǎn)物濃度(考馬斯亮藍(lán)G-250染色法)。加入緩沖液，煮沸3 min后做電泳。電泳前，以1∶1的比例混合蛋白質(zhì)樣品與2×加樣緩沖液。將印跡轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜，先用CTNNB1抗體孵育，然后采用二抗孵育。以β-catenin作為內(nèi)參，檢測(cè)蛋白表達(dá)量(化學(xué)發(fā)光試劑盒)。

MTT：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以1×104/mL接種96孔板，貼壁生長(zhǎng)24 h。采用濃度5 mg/mL PBS溶解甲基噻唑基四唑MTT，然后進(jìn)行過濾。向每孔中加入儲(chǔ)存液10 μL。于37℃孵育4 h，然后加MTT，用100 μL DMSO替換培養(yǎng)基，室溫靜置30 min。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)儀(570 nm)檢測(cè)結(jié)果。分別在轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)測(cè)定每組結(jié)果。細(xì)胞存活率=A1/A2×100%(A1為實(shí)驗(yàn)組吸收率，A2為空白對(duì)照組吸收率)?？v坐標(biāo)為細(xì)胞存活率，橫坐標(biāo)為時(shí)間，繪制生長(zhǎng)曲線。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 18統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，定量資料的描述采用(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

結(jié) 果

靶向CTNNB1 shRNA抑制目的基因的蛋白表達(dá)：通過Westernblot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，β-catenin蛋白表達(dá)分別為：空白對(duì)照組(0.87±0.01)、陰性對(duì)照組(0.85±0.02)、CTN實(shí)驗(yàn)組(0.53±0.02)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：CTN實(shí)驗(yàn)組卵巢癌細(xì)胞株的CTNNB1蛋白表達(dá)下調(diào)率約為36.86%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

轉(zhuǎn)染靶向CTNNB1 shRNA后卵巢癌細(xì)胞增殖被抑制：在MTT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染靶向CTNNB1 shRNA后，明顯抑制了細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)染24 h后，陰性對(duì)照與空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率分別為96.3%和95.4%，顯著高于CTN組(63.5%)。于轉(zhuǎn)染72 h時(shí)檢測(cè)CTN組的細(xì)胞存活率47.7%，而陰性對(duì)照與空白對(duì)照組分別為87.2%和86.1%。于轉(zhuǎn)染后的24 h、72 h時(shí)CTN組的細(xì)胞生長(zhǎng)活性與增殖均顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.05)。

討 論

腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展的過程極其復(fù)雜，目前研究表明wnt/CTNNB1信號(hào)通路參與該過程。而近幾年對(duì)β-catenin與惡性腫瘤的關(guān)系的新認(rèn)識(shí)把有關(guān)CTNNB1的研究推向新的階段。wnt信號(hào)通路在胚胎時(shí)期有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及組織分化的作用，在成體組織中有調(diào)節(jié)干細(xì)胞及組織動(dòng)態(tài)平衡的作用[4]。Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典調(diào)節(jié)方式之一便是通過CTNNB1蛋白去磷酸化、穩(wěn)態(tài)及轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核內(nèi)發(fā)揮作用[5]。轉(zhuǎn)運(yùn)入核后的CTNNB1蛋白與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(TCF)共同調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路下游靶基因可能引起細(xì)胞癌變[6]。研究證明，乳腺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中CTNNB1蛋白的轉(zhuǎn)位是必不可少的[7]。越來越多的研究提示，CTNNB1編碼蛋白在腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中可能起著重要的作用[8]。并且近來多項(xiàng)體外、體內(nèi)研究表明，靶向CTNNB1蛋白可在腫瘤早期階段抑制其發(fā)展、轉(zhuǎn)移[9]。

本實(shí)驗(yàn)通過shRNA干擾技術(shù)、Westernblot、MMT方法，進(jìn)一步證明了在卵巢癌細(xì)胞中抑制CTNNB1的表達(dá)可有效抑制細(xì)胞增殖，提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生。

圖1 特異性RNA干擾介導(dǎo)的CTNNB1蛋白表達(dá)下降

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Study on the growth of ovarian cancer cells after CTNNB1 gene silencing

Chen Fangxu,Liu Haiyan(Corresponding author),Liu Jianwei
The First Hospital Affiliated to Jinzhou Medical University 121001

Objective:To investigate the effect of CTNNB1 silencing on the proliferation of ovarian cancer cells.Methods:Human ovarian cancer SKOV3 cells were cultured in vitro,and then randomly divided into the blank control group,the negative control group and the CTN experimental group,and then transfected into shRNA vector plasmid targeting CTNNB1.Westernblot and MMT were used to detect the expression of CTNNB1 and cell viability.Results:CTNNB1 targeting shRNA can down regulate the expression of CTNNB1 protein in cells(P＜0.05).After transfection with CTNNB1 shRNA,the cell growth and proliferation of CTN group were significantly inhibited(P＜0.05).Conclusion:Down regulation of CTNNB1 gene can inhibit the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells.

Oophoroma;CTNNB1;ShRNA

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.16.1