優(yōu)化石菖蒲組份配伍對谷氨酸致PC12細胞損傷的保護作用

鐘言 曾志杰 龔玉瀅 陳曉燕 陳云波 魏剛 程淑意 周瑩

優(yōu)化石菖蒲組份配伍對谷氨酸致PC12細胞損傷的保護作用

鐘言 曾志杰 龔玉瀅 陳曉燕 陳云波 魏剛 程淑意 周瑩

目的 探討優(yōu)化石菖蒲組份配伍對谷氨酸致PC12細胞損傷的保護作用。方法 對PC12細胞進行體外培養(yǎng),使用的模型是谷氨酸促使PC12細胞出現(xiàn)損傷,將其分成β-細辛醚、丁香酚不同濃度配伍組及β-細辛醚單體組、丁香酚單體組、谷氨酸損傷模型組、正常對照組進行篩選試驗,對損傷PC12細胞活力(OD值)變化情況進行測算,使谷氨酸促使PC12細胞出現(xiàn)損傷保護作用的丁香酚配伍與β-細辛醚的最佳配比進行有效的篩選。結(jié)果 取最低濃度考慮β-細辛醚單體和丁香酚單體的起效濃度分別為49 μmol/L和14 μmol/L。本次結(jié)果顯示細胞OD值9 μmol/L∶14 μmol/L組>9 μmol/L∶2 μmol/L組>49 μmol/L∶0.5 μmol/L組>49 μmol/L∶14 μmol/L組>9 μmol/L∶0.5 μmol/L組>1.9 μmol/L∶14 μmol/L組>49 μmol/L∶2 μmol/L組>正常對照組>β-細辛醚單體組>1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L組>1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L組>丁香酚單體組>谷氨酸損傷模型組,OD值分別為(1.88±0.04)、(1.80±0.05)、(1.80±0.03)、(1.79±0.07)、(1.79±0.02)、(1.78±0.03)、(1.76±0.05)、(1.72±0.07)、(1.72±0.06)、(1.72±0.04)、(1.71±0.03)、(1.68±0.08)、(1.65±0.05)。除丁香酚單體組,其余各組OD值與谷氨酸損傷模型組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 β-細辛醚與丁香酚配伍對谷氨酸致PC12細胞損傷保護作用的較佳的濃度配比可能在9 μmol/L∶0.5 μmol/L～9 μmol/L∶2 μmol/L之間。

β-細辛醚；丁香酚；谷氨酸；PC12細胞；優(yōu)化

β-細辛醚和丁香酚是從中藥石菖蒲中提取的兩種主要有效成份,阿爾茨海默病(AD)是與谷氨酸密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,且呈緩慢進行性發(fā)展［1-3］,神經(jīng)細胞突觸中的谷氨酸可急劇增多,一般出現(xiàn)在缺氧、缺血、創(chuàng)傷和昏厥,嚴重可導致神經(jīng)細胞死亡,有研究表明,石菖蒲中的β-細辛醚和丁香酚對神經(jīng)細胞的退變可起到保護的作用。為了研究通過中藥組份配伍而達到減毒、增效的目的,本研究通過優(yōu)化β-細辛醚和丁香酚的濃度配比,從而篩選出對谷氨酸致PC12細胞損傷保護作用的較佳的濃度配比。

1 材料與方法

1.1 試劑及其配制、細胞株、儀器 上海同仁試劑公司提供的CCK8試劑盒；HyClone公司提供的馬血清,GIBCO公司提供的特級胎牛血清,GIBCO公司提供的高糖DMEM培養(yǎng)基,GIBCO公司提供的胰蛋白酶,其濃度為0.25%,GIBCO公司提供的DPBS緩沖液,廣州中醫(yī)藥大學新藥研究開發(fā)中心提供的β-細辛醚、丁香酚單體(各1 mmol/L,保存于4℃的冰箱中),北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心提供的L-谷氨酸、低分化PC12細胞。TECAN DNA Expert提供的酶標儀,德國Binder CB150提供的CO2培養(yǎng)箱。采用高糖DMEM培養(yǎng)基分別配制2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和40 mmol/L的L-谷氨酸,并保存于4℃的冰箱中備用。PC12細胞的傳代培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱進行,而其需生長在83%高糖DMEM培養(yǎng)基、8%特級胎牛血清和8%馬血清中,體積分數(shù)為5,培養(yǎng)溫度控制在37℃。每隔3 d更換1次培養(yǎng)液,直到細胞呈對數(shù)增長,稀釋細胞至1×105/ml并加入到96孔板中,每孔為100 μl。

1.2 研究方法

1.2.1 對PC12細胞谷氨酸損傷模型進行創(chuàng)建 PC12細胞生長出現(xiàn)貼壁時,且交叉成網(wǎng)時,采用DPBS進行蕩洗,然后棄培養(yǎng)基,隨機分成五組,每組10孔,谷氨酸組加入含有不同濃度谷氨酸的DMEM培養(yǎng)基,正常對照組則向每孔加入高糖DMEM培養(yǎng)基100 μl,在培養(yǎng)16、24、32、48 h時觀察細胞形態(tài)的變化,然后再加入CCK8稀釋液,每孔為20 μl。于90 min后測定其450 nm處的OD值,其中較好的造模濃度和時間分別為10 mmol/L和16 h。

1.2.2 篩選單體、配伍濃度 江湧等［4］研究結(jié)果顯示,β-細辛醚單體的起效濃度為50 μmol/L,而丁香酚單體的起效濃度為15 μmol/L。參照上述研究的單體起效濃度,設(shè)置β-細辛醚單體4個組,其濃度分別為200、100、50、25 μmol/L；設(shè)置丁香酚單體4個組,其濃度分別為60、30、15、7.5 μmol/L。兩單體的起效濃度以5倍的比例進行減小,配伍組按照兩兩配對的標準。對β-細辛醚進行單獨設(shè)置：丁香酚包括9個配伍組,即1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L、1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L、1.9 μmol/L∶14 μmol/L、9 μmol/L∶0.5 μmol/L、9 μmol/L∶2 μmol/L、9 μmol/L∶14 μmol/L、49 μmol/L∶0.5 μmol/L、49 μmol/L∶2 μmol/L和49 μmol/L∶14 μmol/L。每組都進行預給藥,將時間記錄好,4 h后將谷氨酸加入其中,谷氨酸濃度為9 mmol/L,接著再培養(yǎng)16 h,最后采用CCK8法檢測OD值。對細胞形態(tài)學的變化情況進行認真觀察,篩選誘導PC12細胞損傷保護作用的谷氨酸最佳濃度配伍比。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,CCK8法測OD值均采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

取最低濃度考慮β-細辛醚單體和丁香酚單體的起效濃度分別為49 μmol/L和14 μmol/L。本次結(jié)果顯示細胞OD值9 μmol/L∶14 μmol/L組>9 μmol/L∶2 μmol/L組>49 μmol/L∶0.5 μmol/L組>49 μmol/L∶14 μmol/L組>9 μmol/L∶0.5 μmol/L組>1.9 μmol/L∶14 μmol/L組>49 μmol/L∶2 μmol/L組>正常對照組>β-細辛醚單體組>1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L組>1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L組>丁香酚單體組>谷氨酸損傷模型組,OD值分別為(1.88±0.04)、(1.80±0.05)、(1.80±0.03)、(1.79±0.07)、(1.79±0.02)、(1.78±0.03)、(1.76±0.05)、(1.72±0.07)、(1.72±0.06)、(1.72±0.04)、(1.71±0.03)、(1.68±0.08)、(1.65±0.05)。除丁香酚單體組,其余各組OD值與谷氨酸損傷模型組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度配伍比例及β-細辛醚單體、丁香酚單體對PC12細胞OD值的影響(±s)

表1 不同濃度配伍比例及β-細辛醚單體、丁香酚單體對PC12細胞OD值的影響(±s)

注：與谷氨酸損傷模型組比較,aP<0.05

組別 比例數(shù) OD值1.9 μmol/L:0.5 μmol/L組 7 1.71±0.03a1.9 μmol/L:2.9 μmol/L組 7 1.72±0.04a1.9 μmol/L:14 μmol/L組 7 1.78±0.03a9 μmol/L:0.5 μmol/L組 7 1.79±0.02a9 μmol/L:2 μmol/L組 7 1.80±0.05a9 μmol/L:14 μmol/L組 7 1.88±0.04a49 μmol/L:0.5 μmol/L組 7 1.80±0.03a49 μmol/L:2 μmol/L組 7 1.76±0.05a49 μmol/L:14 μmol/L組 7 1.79±0.07aβ-細辛醚單體組 9 1.72±0.06a丁香酚單體組 9 1.68±0.08谷氨酸損傷模型組 9 1.65±0.05正常對照組 9 1.72±0.07a

3 小結(jié)

具有神經(jīng)元特性的PC12細胞為國際公認的可模擬神經(jīng)細胞功能的細胞,主要來源大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤,而過量的谷氨酸會對其造成損傷［5-8］。已有研究者［9］建立Aβ1-40誘導PC12細胞死亡這一模型,并證實了起到保護作用的為丁香酚和β-細辛醚這兩種成分,其皆取自中藥石菖蒲,鈣拮抗作用及穩(wěn)定細胞線粒體膜電位可能為其作用機制。本研究結(jié)果表明β-細辛醚與丁香酚的配比濃度為9 μmol/L∶2 μmol/L的配伍組合,能在1/5的單體劑量下發(fā)揮保護作用,作用顯著。多成份的綜合作用體現(xiàn)中藥的療效,與單體進行配伍組合以及篩選會發(fā)揮較好的減毒作用。

［1］陳奕芝,方永奇,梁毅,等.β-細辛醚對谷氨酸所致PC12細胞損傷的保護作用.中國中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(6):22-23.

［2］陳奕芝,王綺雯,梁毅,等.β-細辛醚對谷氨酸所致腦皮層神經(jīng)元損傷的保護作用.中藥材,2007,30(4):436-439.

［3］江湧,方永奇,何玉萍.石菖蒲有效成分配伍對Aβ?lián)p傷PC12細胞的保護作用.中藥新藥與臨床藥理,2006,17(5):335-338.

［4］江湧,方永奇,魏剛,等.優(yōu)選細辛醚組合對β-淀粉樣蛋白誘導PC12細胞損傷的保護作用.湖北中醫(yī)藥大學學報,2007,9(1):15-17.

［5］Biagas K.Hypoxic-ischemic brain injury: advancements in the understanding of mechanisms and potential avenues for therapy.Current Opinion in Pediatrics,1999,11(3):223-228.

［6］虞希沖,朱桐君.谷氨酸轉(zhuǎn)運體、谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運體與谷氨酸神經(jīng)細胞毒作用.中國臨床藥理學與治療學,2003,8(5):490-493.

［7］謝振華,劉長振,王愛民,等.PC12細胞中氧化還原因子-1對過氧化氫和谷氨酸損傷的不同反應.毒理學雜志,2007,21(4): 245-247.

［8］陳奕芝,方永奇,梁毅,等.β-細辛醚對谷氨酸誘導損傷的腦皮層神經(jīng)元凋亡線粒體膜電位和超微結(jié)構(gòu)的影響.卒中與神經(jīng)疾病,2007,14(5):263-266.

［9］Irie Y,Keung WM.Rhizoma acori graminei and its active principles protect PC12 cells from the toxic effect of amyloid-β peptide.Brain Research,2003,963(1-2):282.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.06.098

2017-01-19］

國家科技重大專項(重大新藥創(chuàng)制)項目(項目編號：2009ZX09103-429),2010年廣州中醫(yī)藥大學本科生創(chuàng)新實驗項目

510405 廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院(鐘言曾志杰 龔玉瀅 陳曉燕)；廣州中醫(yī)藥大學臨床藥理研究所DME中心(陳云波 程淑意 周瑩)；廣州中醫(yī)藥大學新藥開發(fā)研究中心(魏剛)

陳云波