HPLC法同時測定注射用甲硫氨酸維B1中兩組分的含量

陶義華

摘 要：目的：建立一種用HPLC法測定注射用甲硫氨酸維B1中甲硫氨酸和維B1含量的新方法。方法：采用Kromasil氨基鍵合硅膠柱（250mm×4.6mm；5μm），以（0.02mol·L-1）磷酸二氫鉀溶液-乙腈（22：78）為流動相，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為214nm，以外標法測定。結果：在甲硫氨酸濃度20?g·mL-1～4mg·mL-1范圍內，呈良好線性關系（r=1.0000），平均回收率（n=9）為99.7%；在維生素B1濃度2?g·mL-1～0.4mg·mL-1范圍內，呈良好線性關系（r=0.9999），平均回收率（n=9）為99.8%。結論：方法快速、簡便、準確，結果準確可靠，適用于注射用甲硫氨酸維B1中兩組分的含量測定。

關鍵詞：高效液相色譜法 甲硫氨酸 維生素B1 含量測定

注射用甲硫氨酸維B1是一種復方制劑，本品主要成分為甲硫氨酸和維生素B1。其中甲硫氨酸是人體必需氨基酸，但是人體內又無法自行制造，需由飲食攝取。甲硫氨酸能輔助脂肪分解，幫助肝臟脂肪的代謝，預防肝臟及動脈的脂肪堆積，而脂肪會阻礙血流到腦部、心臟及腎臟，還能組成抗脂肪肝形成的化合物⑴。保持血液流順通暢至腎臟、心臟、大腦等，抵抗人體內臟受到自由基地侵害。維生素B1是人體能量代謝，特別是糖代謝所必需的。當人體的能量主要來源于糖類時，維生素B1的需要量最大。維生素B1還是維持心臟，神經及消化系統正常功能所必需的⑵。

本品能改善肝臟功能，對多數的肝臟疾病，特別是急慢性肝炎、肝硬化，尤其對脂肪肝有特別的療效；并可用作肝內膽積，酒精、巴比妥類、磺胺類藥物中毒時的輔助治療；還可以清除心腦血管的脂肪，治療動脈硬化引起的各種疾病，并可作為治療神經炎和心肌炎的輔助藥物。

WS-10001-（HD-1387）-2003甲硫氨酸維B1注射液質量標準⑶中含量測定項下維B1含量為重量法，甲硫氨酸含量為非水滴定法，考慮到實際操作中分別對兩組分進行測定，耗時較長，且維B1含量測定法用于定量重現性較差，為保證實際分析中的準確方便，本文采用高效液相色譜法同時測定甲硫氨酸維B1注射液中2種有效成分的含量，所用色譜條件可使2組分分離度符合規定。理論板數按維生素B1峰計算應不低于3000，方法簡便，靈敏度高，重現性較好。

1、儀器與試藥

Shimadzu LC-10Atvp型高效液相色譜儀及CLASS-VP色譜工作站，METTLER AE240型電子分析天平，維生素B1對照品（中國藥品生物制品檢定所），甲硫氨酸對照品（購買自晉州冀榮氨基酸有限公司），純度為99.8%；甲硫氨酸維B1注射液為自制（規格：5mL：甲硫氨酸100mg與維生素B1 10mg）（批號：050604，050605，050603）；磷酸二氫鉀為分析純；乙腈為色譜純；水為重蒸水。

2、色譜條件

色譜柱：Kromasil氨基鍵合硅膠柱（250mm×4.6mm；5μm）；流動相：0.02mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-乙腈（22：78）；流速為1.0mL·min-1，檢測波長214nm，進樣量10?l。用外標法測定。

3、線性關系

分別精密稱取甲硫氨酸及維生素B1對照品各適量，加流動相溶解并制成每1ml中含甲硫氨酸4mg、維生素B1 0.4mg的溶液，作為線性貯備液。精密量取貯備液0.5，5ml分別置100ml量瓶中，另量取2.5，5ml分別置10ml量瓶中，分別加流動相稀釋并定容，加上貯備液得到5個線性溶液。取各線性溶液各10?l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以兩次測定的峰面積平均值（A）對對照品濃度（C）進行線性回歸，甲硫氨酸、維生素B1回歸方程分別為：

A = 7691.1C + 47097 r=0.9998

A= 34581C – 24647 r=0.9999

以上兩種成分的濃度分別在20?g·mL-1～4mg·mL-1和2?g·mL-1～0.4mg·mL-1范圍內與峰面積呈良好線性關系。

4、穩定性試驗

取上述線性關系中甲硫氨酸濃度為2mg·mL-1和維生素B1濃度為0.2mg·mL-1的溶液，在放置0、2、4、8小時測定進樣，測定峰面積。甲硫氨酸峰面積的RSD為0.41%，維生素B1峰面積的RSD為0.70%，結果見下表：

結果表明溶液在8小時內穩定。

5、儀器精密度試驗

取上述線性關系中甲硫氨酸濃度為2mg·mL-1和維生素B1濃度為0.2mg·mL-1的溶液，重復5次，測定峰面積，甲硫氨酸峰面積的RSD為0.64%，維生素B1峰面積的RSD為0.53%（n=5），表明進樣精密度良好。

6、日間精密度試驗

取050604批樣品5瓶，精密稱定內容物，混勻，精密稱取適量（約相當于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流動相稀釋并制成每1mL含甲硫氨酸2mg、維生素B1 0.2mg的溶液，平行2份，作為供試品溶液，照樣品含量測定項方法分別與第1、2、3、4、5d測定含量，5次測定含量的甲硫氨酸RSD為0.94%，維生素B1 0.78%。

7、回收率試驗

精密稱取甲硫氨酸80，100，120mg（相當于處方量的80%，100%，120%）各3份，分別精密加入維生素B1 8，10，12mg（相當于處方量的80%，100%，120%）各3份，分別置50mL量瓶中，按照處方比例加入各種輔料，加流動相溶解并稀釋至刻度，制成每1mL約含甲硫氨酸1.6，2.0，2.4mg和維生素B1 0.16，0.20，0.24mg的溶液，各精密量取10?l注入液相色譜儀，計算回收率。結果甲硫氨酸、維生素B1高、中、低3個濃度的回收率分別為100.09%、99.30%、99.81%；99.79%、99.55%、100.05%。RSD分別為0.53%、0.97%、1.07%；0.57%、0.73%、0.17%。總的平均回收率（n=9）分別為99.7%，99.8%。

8、重復性試驗

精密稱取050604批樣品適量（約相當于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流動相溶解并制成每1ml含甲硫氨酸2mg、維生素B1 0.2mg的溶液，平行測定5次含量，甲硫氨酸和維生素B1的平均標示量的百分含量分別為101.3%，100.8%；RSD分別為0.50%，0.42%（n=5）。

9、樣品測定

分別取三批樣品各5瓶，精密稱定內容物，混勻，各精密稱取適量（約相當于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流動相稀釋并制成每1mL含甲硫氨酸2mg、維生素B1 0.2mg的溶液，各平行2份，作為供試品溶液，另取甲硫氨酸對照品與維生素B1對照品適量，同法配制成每1mL中約含甲硫氨酸2mg和維生素B1 0.2mg的溶液，作為對照品溶液。各精密量取10?l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法以峰面積計算，即得。3批樣品的含量結果見表1。

10、討論

10.1 檢測波長的選擇

我們研制的樣品為凍干劑型，為更好的控制產品質量，我們對含量測定方法進行改進。含量測定參考注射用水溶性維生素部版質量標準⑷中維生素B1含量測定的波長214nm，我們對此波長進行驗證，分別取甲硫氨酸和維生素B1對照品各適量，加流動相溶解制成每1mL中含甲硫氨酸2mg和維生素B10.2mg的混合溶液，進樣，記錄色譜圖，并由二極管陣列檢測器得到2種成分的紫外光譜圖（圖2），根據兩組分的紫外光譜圖，考慮到兩組分均能有較強的響應，因此確定本品含量測定波長為214nm。從兩組分的HPLC圖中可看出（圖1），甲硫氨酸有較強的響應，峰形良好，維生素B1也有較強的吸收，峰形良好，兩組分的分離度大于3.0，柱效均大于5000，系統適用性良好。

10.2 流動相的選擇

注射用水溶性維生素部版質量標準中維生素B1含量測定的色譜條件為：[以（0.02mol·L-1）磷酸二氫鉀溶液-乙腈（27：73），用10%鹽酸溶液調節pH值為5.3的溶液為流動相，經試驗此色譜條件甲硫氨酸和維B1未完全分開，分離度小于1.5，調節水相為（0.02 mol·L-1）磷酸二氫鉀溶液，不用調節水相的pH值，調節比例為水相：乙腈（22：78），在此條件下甲硫氨酸和維B1分離度大于3.0，兩主成分峰形較好，柱效均大于5000（見圖1）。

因此確定流動相為：以（0.02 mol·L-1）磷酸二氫鉀溶液-乙腈（22：78）。

10.3 方法學考察及實際樣品的測定結果顯示，本方法操作簡便，快捷，結果準確可靠，一次進樣即可得到2種成分的含量測定結果，且流動相經濟易得，便于在實際生產及檢驗中使用，提高了工作效率。

參考文獻

[1]楊靜等，S-腺苷甲硫氨酸的臨床及藥理研究進展，藥學進展，2001，25（3）：164～167.

[2]劉景民等，維生素B1在人體內的作用，實用中西醫結合雜志，1995，8（8）：608.

[3]國家藥品標準：WS-10001-（HD-1387）-2003甲硫氨酸維B1注射液.

[4]衛生部1996年版藥品標準：注射用水溶性維生素質量標準.