干擾表皮生長因子受體表達對腦出血后星形膠質細胞活化的影響及其機制

伍正彬, 羅大林, 蔣東坡

(1. 重慶市東南醫院 ICU, 重慶, 401336; 2. 第三軍醫大學附屬第三醫院 重癥醫學科, 重慶, 400042)

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干擾表皮生長因子受體表達對腦出血后星形膠質細胞活化的影響及其機制

伍正彬1, 羅大林2, 蔣東坡2

(1. 重慶市東南醫院 ICU, 重慶, 401336; 2. 第三軍醫大學附屬第三醫院 重癥醫學科, 重慶, 400042)

目的 觀察干擾表皮生長因子受體(EGFR)表達對腦出血后星形膠質細胞活化的影響。方法 注射Ⅶ型膠原酶制備腦出血模型大鼠，同時設置假手術組作為對照。術后7 d, 行神經功能評分判斷造模成功與否。取腦出血模型大鼠和假手術大鼠，行SP免疫組化法檢測腦組織EGFR和神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達。分離新生大鼠皮層星形膠質細胞，體外培養。觀察干擾EGFR表達對細胞的影響，實驗分4組: ① 對照組：不處理; ② 重組大鼠睫狀神經營養因子(CNTF)組：加入20 μg/L CNTF; ③ 陰性組：加入20 μg/L CNTF, 并轉染EGFR siRNA陰性對照; ④ EGFR組：加入20 μg/L CNTF, 并轉染EGFR siRNA。采用實時熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測各組細胞EGFR、GFAP、磷酸化酪胺酸激酶JAK1(p-JAK1)、磷酸化信號傳導與轉錄激活因子3(p-STAT3)的表達。結果 腦出血模型大鼠造模成功率89.5%(17/19)。腦出血模型大鼠腦組織EGFR和GFAP表達顯著高于假手術組(P<0.05)。EGFR組EGFR mRNA和蛋白相對表達量顯著低于對照組、CNTF組和陰性組(P<0.05)。CNTF組和陰性組GFAP mRNA和蛋白相對表達量顯著高于對照組和EGFR組(P<0.05), 而對照組和EGFR組比較無顯著差異(P>0.05)。 CNTF組和陰性組p-JAK1和p-STAT3蛋白相對表達量顯著高于對照組和EGFR組(P<0.05), 而對照組和EGFR組比較無顯著差異(P>0.05)。結論 腦出血大鼠EGFR和GFAP表達升高，星形膠質細胞活化。干擾EGFR表達可抑制大鼠星形膠質細胞活化，其機制可能與阻滯JAK1和STAT3磷酸化有關。

表皮生長因子; 神經膠質纖維酸性蛋白; 磷酸化酪胺酸激酶JAK1; 磷酸化信號傳導與轉錄激活因子3;星形膠質細胞

腦出血是ICU常見的危急重癥之一，死亡率和致殘率極高，不僅嚴重影響患者生命健康和生活質量，還給家庭和社會造成沉重的經濟負擔[1]。腦出血后繼發的腦損傷是導致患者預后不良的主要因素之一，這種繼發性損傷機制相當復雜，眾多學者也做了大量研究，但其具體機制尚不十分明確。近年來有研究[2-3]認為，星形膠質細胞活化在腦出血后繼發性腦損傷過程中扮演重要角色，是引起繼發性腦損傷的重要效應細胞。有研究[4]發現，中風、顱腦損傷等中樞神經系統損傷患者，腦組織中表皮生長因子受體(EGFR)表達顯著增加，且大多表達在活化的星形膠質細胞中，推測EGFR可能在星形膠質細胞活化過程中發揮作用。本研究通過構建腦出血模型大鼠和體外培養大鼠皮層星形膠質細胞，觀察EGFR對腦出血后星形膠質細胞活化的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

Sprague-Dawley健康大鼠40只, 3 d以內的新生大鼠10只，均購自中國科學院北京斯萊克實驗動物中心(SCXK京2011-0012)。新生大鼠購回次日即用于皮層星形膠質細胞分離，其他大鼠購回后適應性飼養2周后再用于實驗。SP免疫組織化學檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠EGFR、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、磷酸化酪胺酸激酶JAK1(p-JAK1)、磷酸化信號傳導與轉錄激活因子3(p-STAT3), 以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG均購自美國Santa Cruz公司。DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素雙抗均購自美國Gibco公司。EGFR siRNA及其陰性對照核苷酸序列均委托上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。EGFR siRNA上游: 5′-CCUUAGCAGUCUUAUCUAATDT-3'; 下游: 5′-dTdTGGAAUCGUCAGAAUAGAUU-3′。陰性對照上游: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′; 下游: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。重組大鼠睫狀神經營養因子(CNTF)購自美國R&D Systems公司。Lipofectamine 2000轉染試劑、TRIzol總RNA提取試劑均購自美國Invitrogen公司。反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國ABI Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腦出血模型大鼠制備：制備腦出血模型大鼠共20只。參照文獻[5]標準, 10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉，俯臥固定于鼠腦立體定向儀上。參照鼠腦立體定位儀圖譜，開一骨窗，通過微量注射器注入2 μL的Ⅶ型膠原酶(0.20 U/μL), 逐層縫合傷口，抗生素預防感染，自然蘇醒后常規飼養。同時取20只大鼠行同樣的開骨窗操作，注入等量生理鹽水，其余操作相同，作為假手術組。術后7 d, 采用Bederson評分法行神經功能評分以判斷造模是否成功。0分：神經功能無缺失; 1分：提尾倒掛時損傷對側前肢屈曲; 2分：前肢屈曲及對側抵抗推力下降; 3分：向對側轉圈; 4分：向對側轉圈及意識障礙。1～3分視為造模成功。

1.2.2 免疫組化檢測EGFR和GFAP表達：腦出血模型大鼠和假手術大鼠各10只，取腦組織, 10%中性甲醛固定，石蠟包埋, 4 μm連續切片。行SP免疫組化法檢測EGFR和GFAP表達。具體步驟: 4 μm組織切片, 60 ℃烤片2 h, 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化; 37 ℃的3% H2O2溶液孵育10 min, 檸檬酸高壓抗原修復法修復; PBS洗凈，加入兔抗大鼠一抗(抗GFAP、抗EGFR)工作液, 4 ℃孵育24 h; PBS洗凈，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗工作液, 37 ℃孵育30 min; 顯色劑顯色，蘇木素復染，梯度乙醇水化，二甲苯透明，最后封片。根據陽性細胞比例和染色程度行半定量分析[6]: 陽性細胞比例<5%、5%～24%、25%～50%、51%～74%、>75%, 分別計為0、1、2、3、4分; 無、弱、中、強染色，分別計為0、1、2、3分。綜合兩項計分之和: 0分陰性(-), 1～2分弱陽性(+), 3～5分中度陽性(2+), 6～7分強陽性(3+)。

1.2.3 大鼠皮層星形膠質細胞分離培養: 3 d以內的新生大鼠5只，取大腦皮層組織，剪碎成小塊, 0.25%胰蛋白酶消化30 min, 胎牛血清終止消化, 1 000 r/min離心5 min, 棄去上層液體，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液, 100目篩網過濾，調整細胞密度至4×108個/L，轉移至細胞培養瓶, 37 ℃、5% CO2培養箱中培養。隔3 d更換培養液，細胞生長至85%融合時, 0.25%胰酶消化、傳代。收集處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.4 EGFR siRNA轉染實驗分組與處理：處于對數生長期的星形膠質細胞接種于6孔板，實驗分4組: ① 對照組：正常培養，不處理; ② CNTF組：加入20 μg/L的CNTF; ③ 陰性組：加入20 μg/L的CNTF, 并轉染EGFR siRNA陰性對照; ④ EGFR組：加入20 μg/L的CNTF, 并轉染EGFR siRNA。轉染方法: EP管中配置轉染A液(EGFR siRNA或其陰性對照各100 μL+無血清DMEM培養基100 μL), 轉染B液(Lipofectamine 2000 5 μL+無血清DMEM培養基100 μL)。混合A、B液，室溫靜置20 min。取出正常培養的星形膠質細胞，棄去原培養液，加入A/B混合液。孵育6 h，棄去轉染液，更換為含10%胎牛血清的正常培養液繼續培養。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達：收集各組細胞, TRIzol法提取細胞總RNA, 核酸蛋白分析儀進行RNA質量評估，若A260/A280為1.8～2.0, 則滿足實驗要求。按反轉錄試劑盒操作反轉錄成合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，引物委托上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。EGFR上游: 5′-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3′; 下游: 5′-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3′。GFAP上游: 5′-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3′; 下游: 5′-TTCGCCCTCCGCAATTTC-3′。GAPDH 上游: 5′-GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC-3′; 下游: 5′-ATGCCTGCTTCACCACCACCTTG -3′。擴增條件: 94 ℃ 3 min, 94 ℃ 1 min, 61 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共35個循環, 72 ℃ 7 min。采用2-△△Ct計算目的基因相對含量(RQ), RQ=2-△△Ct。

1.2.6 蛋白印跡法檢測蛋白表達：收集各組細胞，冰浴下加RIPA細胞裂解液。裂解30 minG 轉移至離心管G 4 ℃下10 000 r/min離心5 min, 取上清蛋白液。BCA法測定蛋白濃度, -20 ℃保存備用。100μg蛋白上樣，經SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜。TBST漂洗, 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h, 兔抗大鼠一抗(抗EGFR、抗GFAP、抗p-JAK1、抗p-STAT3)工作液, 4 ℃孵育過夜。TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗工作液, 37 ℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室內ECL顯色、曝光。Band Scan 5.0軟件分析條帶光密度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/內參β-actin光密度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件分析所有數據，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用One-way ANOVO單因素方差分析，組內兩兩比較采用SNK-q檢驗。等級資料的比較采用秩和檢驗。取雙側α<0.05為檢測水準，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腦出血模型大鼠腦組織EGFR和GFAP表達

造模大鼠共20只，造模7 d后，因傷口感染死亡1只。剩余19只行神經功能評分證實造模成功17只，造模成功率89.5%(17/19)。取腦出血模型大鼠和假手術大鼠各10只，行免疫組化檢測。腦出血模型大鼠腦組織膠質細胞的胞質中，分布大量黃色至棕黃色的EGFR和GFAP陽性顆粒(圖1-②, 圖1-④), 假手術組大鼠僅見少量表達(圖1-①, 圖1-③)。半定量分析結果表明，腦出血模型大鼠腦組織EGFR和GFAP表達顯著高于假手術組(P<0.05), 見表1。GFAP是星形膠質細胞的特異性標志物，其表達增加說明腦出血模型大鼠星形膠質細胞活化。

①:假手術組大鼠腦組織EGFR表達;②:腦出血模型大鼠腦組織EGFR表達;③:假手術組大鼠腦組織GFAP表達;④:腦出血模型大鼠腦組織GFAP表達圖1 免疫組化檢測假手術組和腦出血模型組大鼠EGFR和GFAP表達(200倍)

表1 手術組和腦出血模型組大鼠EGFR和GFAP表達

與假手術組比較, *P<0.05。

2.2 EGFR siRNA對EGFR表達的影響

與對照組、CNTF組和陰性組比較, EGFR組細胞EGFR mRNA和蛋白相對表達量分別下降91%和87%, 差異有統計學意義(P<0.05); 而對照組、CNTF組和陰性組比較無顯著差異(P>0.05)。說明EGFR siRNA可顯著抑制星形膠質細胞EGFR表達，滿足后續實驗要求。見圖2。

與對照組、CNTF組和陰性組, *P<0.05

圖2 實時熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測EGFR mRNA和蛋白表達

2.3 干擾EGFR表達對星形膠質細胞活化的影響

與對照組比較, CNTF組和陰性組細胞GFAP mRNA和蛋白相對表達量顯著增加(P<0.05), 而CNTF組和陰性組比較無顯著差異(P>0.05)。與CNTF組和陰性組比較, EGFR組細胞GFAP mRNA和蛋白相對表達量顯著減少(P<0.05), 且與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。GFAP是星形膠質細胞的特異性標志物，其表達增加說明CNTF可明顯活化星形膠質細胞，而干擾EGFR表達可抑制CNTF引起的星形膠質細胞活化。見圖3。

與對照組比較, *P<0.05;與CNTF組和陰性組比較, #P<0.05

圖3 實時熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測GFAP mRNA和蛋白表達

2.4 干擾EGFR表達對p-JAK1和p-STAT3表達的影響

與對照組比較, CNTF組和陰性組細胞p-JAK1和p-STAT3蛋白相對表達量顯著增加(P<0.05), 而CNTF組和陰性組比較無顯著差異(P>0.05)。與CNTF組和陰性組比較, EGFR組細胞p-JAK1和p-STAT3蛋白相對表達量顯著減少(P<0.05), 且與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。說明星形膠質細胞活化可能與JAK1和STAT3磷酸化有關，而干擾EGFR表達可阻滯JAK1和STAT3磷酸化。見圖4。

與對照組比較,*P<0.05;與CNTF組和陰性組比較,#P<0.05圖4 蛋白印跡法檢測p-JAK1和p-STAT3蛋白表達

3 討 論

星形膠質細胞是中樞神經系統中數量最多的細胞，對神經元具有支持和滋養的作用。近年來，有關星形膠質細胞在中樞神經系統損傷或病變過程中的作用研究備受青睞。通常情況下星形膠質細胞存在靜止和活化兩種細胞形態，而腦出血發生時，其迅速從靜止態轉變為活化態。一般認為活化的星形膠質細胞具有雙重作用[7-8]: 一方面，腦出血損傷早期，通過分泌多種細胞因子和神經營養因子，增強神經元對缺血、缺氧的耐受能力，從而保護神經元; 另一方面，過度增殖形成的膠質瘢痕阻礙軸突的再生、延長和融合; 膠質瘢痕還可壓迫微血管，影響腦組織局部血液供應，造成繼發性損傷。多數學者[9]認為，腦出血后活化的星形膠質細胞對神經元的損傷作用大于其保護作用，被認為是引起腦出血后繼發性腦損傷的關鍵因素之一。GFAP是一種僅見于星形膠質細胞的Ⅲ型中間絲狀蛋白，參與細胞骨架的構成。Gomes等[10]研究證實，星形膠質細胞的活化伴隨著GFAP表達的顯著上調，可認為GFAP是星形膠質細胞活化的特異性標志物。本研究也采用觀察GFAP表達的變化作為判斷星形膠質細胞活化的指標，結果顯示，腦出血模型大鼠腦組織GFAP的表達顯著高于假手術組，這與肖霖等[11]和錢紅等[12]研究結果基本一致。說明腦出血后靜態的星形膠質細胞轉化為活化的星形膠質細胞，而這種轉化在腦出血后繼發性腦損傷中發揮重要作用。

如何有效抑制腦損傷后星形膠質細胞活化，對于促進腦損傷后神經功能恢復，減少繼發性腦損傷，改善患者預后，降低死亡率和致殘率等方面具有重要價值。研究[13]顯示, EGFR 及其下游信號轉導途徑在腦損傷后星形膠質細胞活化中發揮作用。JAKs-STATs是 EGFR 常見的下游信號轉導途徑, EGFR與其配體結合后形成磷酸化的EGFR, 繼而誘導其下游JAKs 磷酸化，并進一步誘導STATs磷酸化。磷酸化的STAT進入細胞核內與靶基因結合，從而調控靶基因的轉錄。既往對于JAKs-STATs信號轉導途徑的研究多著眼于腫瘤方面。如Thompson等[14]研究證實, JAKs-STATs信號轉導途徑抑制劑AG490能有效抑制肝癌細胞的生長。Leung等[15]報道, JAKs-STATs信號轉導途徑參與了星形膠質細胞的增殖、分化過程。Bright等[16]研究發現, JAKs-STATs信號轉導途徑參與了星形膠質細胞的活化，加劇了神經元損傷，阻礙神經功能恢復。

本研究采用EGFR siRNA干擾EGFR表達，結果發現EGFR表達顯著降低。本研究隨后用CNTF處理體外培養大鼠星形膠質細胞。結果發現, CNTF能顯著上調細胞GFAP表達，而EGFR siRNA完全抑制了CNTF誘導的GFAP表達。說明CNTF可明顯活化星形膠質細胞，而干擾EGFR表達可抑制CNTF引起的星形膠質細胞活化。為了進一步探討EGFR抑制星形膠質細胞活化的相關機制，本研究進一步檢測了各組細胞p-JAK1和p-STAT3的表達。結果發現, CNTF在上調GFAP表達的同時顯著上調了JAK1和STAT3的表達，而EGFR siRNA可顯著抑制CNTF介導的JAK1和STAT3表達。說明干擾EGFR表達抑制星形膠質細胞活化可能與阻滯JAK1和STAT3磷酸化有關。

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Effects of EGFR interference on activation of astrocytes after intra-cerebral hemorrhage and its mechanism

WU Zhengbin1, LUO Dalin2, JIANG Dongpo2

(1.ICU,ChongqingSoutheastHospital,Chongqing, 401336; 2.DepartmentofCriticalCareMedicine,TheThirdHospitalAffiliatedtoTheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400042)

Objective To investigate the effects of epidermal growth factor receptor (EGFR) interference on activation of astrocytes after intra-cerebral hemorrhage and its mechanism. Methods Rat model of intra-cerebral hemorrhage was induced by injection of Ⅶ collagenase. Sham operation group was set as control. After 7 d, the neurological function score was used to judge whether the model was successful or not. The expression of EGFR and GFAP in brain tissue of rats in intra-cerebral hemorrhage group and sham operation group were detected by SP immunohistochemical method. Astrocytes were isolated from newborn rats' cerebral cortex and cultured in vivo. Effects of EGFR interference on activation of astrocytes were observed. The experimental rats were divided into 4 groups: ① control group was not handled. ② CNTF group was added with 20 μg/L CNTF. ③ Negative group was added with 20 μg/L CNTF, and EGFR siRNA negative control was transfected. ④ EGFR group was added with 20 μg/L CNTF, and EGFR siRNA was transfected. The expressions of EGFR, GFAP, p-JAK1, p-STAT3 were detected by real-time PCR and Western blot. Results The modeling success rate was 89.5%(17/19). The expressions of EGFR and GFAP in brain tissue of rats with intra-cerebral hemorrhage were significantly higher than those in sham operation group (P<0.05). The relative expressions of EGFR mRNA and protein in EGFR group were significantly lower than those in control group, CNTF group and negative group (P<0.05). The relative expressions of GFAP mRNA and protein in the CNTF group and the negative group were significantly higher than those in the controlgroup and the EGFR group (P<0.05), but there was no significant difference between the control group and the EGFR group (P>0.05). The relative expressions of p-JAK1 and p-STAT3 protein in the CNTF group and the negative group were significantly higher than those in the control group and the EGFR group (P<0.05), but there was no significant difference between the control group and the EGFR group (P>0.05). Conclusion The expressions of EGFR and GFAP significantly increase in the rats with intra-cerebral hemorrhage. Interference of EGFR expression can inhibit the activation of astrocytes in rats, which may be related with the inhibition of JAK1 and STAT3 phosphorylation.

epidermal growth factor; glial fibrillary acidic protein; phosphorylated tyrosine kinase JAK1; phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3; astrocytes

2016-12-20

重慶市科學技術廳項目(0800160365)

羅大林

R 743.34

A

1672-2353(2017)13-012-05

10.7619/jcmp.201713004