類風濕關節炎患者關節液中miRNA表達譜研究及其臨床意義

李 力, 羅曉星

(解放軍第458醫院, 1. 檢驗科; 2. 干部病房, 廣東 廣州, 510062)

?

類風濕關節炎患者關節液中miRNA表達譜研究及其臨床意義

李 力1, 羅曉星2

(解放軍第458醫院, 1. 檢驗科; 2. 干部病房, 廣東 廣州, 510062)

目的 檢測類風濕關節炎(RA)患者與健康對照者關節液中miRNA表達譜差異及臨床意義。方法 應用miRNA芯片技術檢測3例RA患者和3例正常人關節液中miRNAs表達情況，篩選出表達差異顯著的miRNAs, 并采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證。進一步研究候選miRNA與RA臨床和實驗室指標的相關性。結果 RA患者關節液miRNA表達譜中23個miRNA較健康對照者發生顯著改變。qRT-PCR檢測結果與芯片結果相符。RA患者與健康對照者關節液中miR-146a的表達差異最為顯著。Pearson相關分析顯示, RA患者關節液中miR-146a的表達與類風濕因子(RF)和DAS28評分呈正相關。ROC曲線分析結果顯示, miR-146a曲線下面積(AUC)為0.71, 關節液miR-146a預測RA的靈敏度為85.29%, 特異度為61.54%。結論 RA患者關節液與健康人關節液存在表達差異顯著的miRNAs。miR-146a在RA患者關節液中表達顯著升高，其水平與RA的臨床和實驗室指標存在顯著相關性。

類風濕關節炎; miRNA芯片; 關節液; miR-146a

類風濕關節炎(RA)是一種以關節、滑膜的慢性炎癥以及后期關節軟骨和骨質破壞為主要特點的全身性自身免疫性疾病[1]。RA會導致關節畸形和活動受限，最終導致病變關節功能障礙甚至功能喪失。RA病因及發病機制尚不明確，也缺乏療效確切的治療手段。MicroRNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物細胞中的一類內源性的、非編碼的單鏈小分子RNA。miRNA具有調控多個上游基因表達和下游蛋白翻譯的能力，具有調控包括惡性腫瘤形成、免疫炎性反應等病理過程的能力[2]。大量的研究[3-4]顯示，miRNAs在RA發生發展的調控機制中起著非常重要的作用。本研究通過miRNA芯片技術檢測RA患者與健康對照者關節液中miRNA表達譜差異，分析其與RA臨床指標的相關性，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

miRNA芯片檢測對象為解放軍第458醫院接受治療的3例臨床確診的RA患者和3例健康對照者。6例研究對象均為女性，年齡40～57歲。另選擇60例臨床確診的RA患者和30例健康對照者作為研究對象，進行RA早期診斷標志物miRNA的篩選以及與臨床病理特征關系的研究。60例RA患者中男15例，女45例，年齡38～58歲，平均(46.9±11.5)歲; 患病時間(4.2±2.7)年。所有入選RA患者均符合2010年美國風濕病學會(ACR)修訂的RA診斷標準。排除因其他疾病而引起的關節炎，且檢查前1周均未使用過糖皮質激素或非甾體類抗炎藥物。本研究受試者均簽署知情同意書，并經過醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 關節液標本收集：患者取平臥位，膝關節局部消毒麻醉后，取髕上外側入路行膝關節腔穿刺，注射器抽取關節液約2 mL。室溫下靜置1 h, 上離心機2 000 r/min離心15 min, 取上清-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.2 miRNA芯片檢測: ① 總RNA提?。翰捎肨rizol試劑對關節液總RNA進行提取。經過RNA分相、沉淀、洗滌、溶解后, RNA電泳檢測提取RNA分子的完整性, Nanodrop ?ND-1000測定提取RNA的濃度。使用Nanodrop測定RNA 在分光光度計260、280和230 nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。② 制備熒光標記探針：采用miRCURYTMArray Power 標記試劑盒，將Hy3TM熒光基團標記miRNA制備熒光標記探針。③ miRNA芯片雜交、芯片掃描和數據分析：將標記好的探針和miRCURYTM芯片放入PhalanxTM的熱收縮雜交袋進行雜交反應。使用GenePix 4000B芯片對芯片進行原始圖像掃描，并將實驗結果轉換成數字型數據保存。芯片實驗數據采用GenePix pro V6.0軟件對數據聚類分析，計算兩種檢測信號的比值(1og2)。

1.2.3 實時熒光定量PCR驗證：基于芯片結果，對miRNA Foldchange值改變≥2的miRNAs進行驗證。miRNA及U6引物序列購于天根生化科技(北京)有限公司。關節液總RNA提取方法步驟同上。逆轉錄(RT)反應按照miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟構建10 μL反應體系: RNA 3 μL, 1×mirVana RT Primer 1 μL, Array script Enzyme Mix 0.4 μL, mirVana RT Buffer(5×) 2 μL, 加RNase-free water至總體積10 μL。反應條件: 37 ℃, 15 min; 42 ℃, 50 min; 85 ℃, 5 min。按照miRNA SYBR Green PCR Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟進行qRT-PCR反應。反應條件: 95 ℃, 15 min; 95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s共40個PCR循環。實驗重復3次，以U6 snRNA作為內參，數據采用2-ΔΔCT法進行分析(CT值定義為每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數)。采用2-ΔΔCT法對miR-146a表達相對值進行分析。

1.2.4 RA臨床和實驗室指標檢測: DAS28評分[5]: ① 壓痛關節數：檢查雙側近端指間關節、掌指關節、腕關節、肘關節、肩關節及膝關節計28個關節，得出關節觸痛或被動活動時的關節觸痛數; ② 腫脹關節數：檢查上述28個關節腫脹與否，得出腫脹關節數; ③ 紅細胞沉降率(ESR); ④ 最近7 d患者健康狀況或患者對RA病情活動的總體評價：采用0～10 cm標尺, 0表示病情無活動, 10表示病情極度活動，中間部分表示RA不同程度的病情活動，數字越大表示病情活動性越強。DAS 28=0.56×壓痛關節數+0.28×腫脹關節數+0.70×Ln(ESR)×0.014×患者健康狀況評分。DAS 28范圍從0～10分，得分越高提示病情活動性越高。類風濕因子(RF)檢測：采用日立7100型全自動生化分析儀，用免疫速率散射比濁法測定RA患者關節液RF濃度水平。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 miRNA芯片結果

miRNA芯片檢測將表達差異顯著的標準設為：改變倍數上調的或下調2倍以上(P<0.05)。結果如下: RA患者關節液miRNA表達譜中23個miRNA較健康對照者發生顯著改變(表達差異≥2倍)。其中表達上調≥2倍的miRNAs有16個，表達下調≥2倍的miRNAs有7個。見表1。

2.2 qRT-PCR驗證芯片結果

以U6 snRNA為內參，檢測miRNA芯片結果中表達差異顯著的23個miRNAs。qRT-PCR實驗中RA患者和健康人關節液中該23個miRNAs表達水平差異情況與芯片的結果是一致的。

表1 RA患者和健康對照者關節液中差異性表達的miRNAs

2.3 RA患者同健康對照組關節液miR-146a表達水平比較

作者選擇miRNA芯片結果中表達差異最顯著的miR-146a作為候選miRNA進一步檢測。采用qRT-PCR檢測60例RA患者和30例健康對照者關節液miR-146a表達水平。結果顯示：健康對照組人群關節液miR-146a相對表達水平為0.227±0.031, RA患者關節液miR-146a表達顯著升高，其相對表達水平為1.731±0.306, 差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 miR-146a與RA臨床和實驗室指標的相關性分析

Pearson相關分析結果顯示, RA患者關節液miR-146 a表達水平與RF數值和DAS 28評分呈正相關(r=0.472、0.587,P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-146a水平與左室重構程度相關性

2.5 miR-146 a表達水平對RA的診斷效能

以miR-146a相對表達量進行ROC曲線分析，結果顯示, miR-146 a曲線下面積(AUC)為0.71(P<0.01); 關節液miR-146 a預測RA的靈敏度為85.29%, 特異度為61.54%。

3 討 論

隨著醫學界對miRNA開展了廣泛和深入研究, miRNA在各種疾病發生發展中的作用也越來越受到大家的重視。miRNA能通過堿基互補配對的形式與靶基因的3′UTR部分或完全互補，剪切靶基因的轉錄產物或者直接抑制轉錄產物的翻譯，最終在轉錄后水平調控靶基因的表達。miRNA的發現揭示了一種新的基因表達調控方式，即不同miRNA和靶基因之間能夠形成復雜的調控網絡，發揮精細調控功能基因表達的作用[6]。從miRNA與免疫系統的關系來看, miRNA在固有免疫和適應性免疫以及炎癥因子的信號轉導過程中起著重要的調節作用。由于自身免疫功能的紊亂和細胞因子的分泌異常是導致RA發病的關鍵因素[7]。因此，針對miRNA與RA疾病之間的關系也開展了一系列相關研究。2008年Stallczvk等[8]采用RT-PCR方法檢測發現, RA患者滑膜組織中miR-155和miR-146a的表達明顯高于正?；そM織。進一步研究發現, TNF-α、IL-1β、LPS、細菌脂蛋白和poly(I-C)等炎癥相關因子可誘導miR-155的產生。增強miR-155的表達則可以通過Toll樣受體配體(TLR)和細胞因子來抑制基質金屬蛋白酶3(MMP-3)的水平。鄭錫銘等[9]對比研究發現, RA患者血清和關節液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106和miR-130的表達水平明顯高于普通骨關節炎和健康人。相關分析顯示，這些miRNAs與RA的活動性指標RF、ESR和CRP呈正相關。因此，對miRNA和RA之間關系的研究，不僅有助于明確RA發病機制，更可為RA的診斷和治療提供新的切入點。

隨著高靈敏性基因檢測芯片和PCR技術的應用，目前在人體液(如血液、腹腔液、關節液、精液等)中能夠檢測到豐富并且穩定表達的miRNAs[10]。此外，不同疾病相關體液中miRNAs表達譜和表達水平也不同。這種異常改變不僅與疾病病變情況密切相關，也具有很強的特異性。這些特性提示體液中的miRNAs可以作為潛在的疾病生物標志物。關節液主要由關節滑囊和腱鞘的滑液膜分泌。臨床研究[11]證實，關節部位的疾患會導致分泌的關節液中出現病變代謝產物并潴留于關節腔。因此，關節液分子標志物的檢測也是目前關節部位疾病診斷、療效檢測和預后評估最敏感、最有效的指標。本研究首先使用高靈敏的miRNA芯片來初步篩選出RA患者關節液中差異性表達的miRNAs。結果顯示與健康人相比，在RA患者關節液中發現23個明顯異常表達的miRNAs。其中表達上調≥2倍的miRNAs有16個，表達下調≥2倍的miRNAs有7個。其中表達差異最顯著的miR-146a, 其在RA患者關節液中的表達水平為健康人的10多倍。進一步采用熒光定量PCR的方法對芯片檢測結果進行驗證，結果顯示23個異常表達miRNAs在RA患者關節液中表達情況與芯片結果一致。

miR-146a是目前廣泛報道的與固有免疫調節、炎癥反應和惡性腫瘤發生發展密切相關的miRNA[12]。有研究證實, miR-146a能夠通過TLRs/NF-kB炎癥通路來調控炎癥反應[13-14]。Nakasa等[15]研究發現miR-146a在RA患者關節滑膜組織中表達顯著升高。而體外采用TNF-α和IL-1β刺激能夠增強滑膜纖維細胞miR-146a的表達。提示miR-146a與RA炎癥反應過程密切相關。本研究中我們選擇miR-146a作為候選miRNA進一步檢測。通過熒光定量PCR檢測60例RA患者和30例健康對照者關節液miR-146a表達差異情況。RA患者關節液miR-146a表達水平顯著高于健康對照組人群的。DAS 28評分和RF為目前臨床上常用的RA患者病情監測評估指標。DAS 28評分和RF數值越高，RA病情活動度越大，病情越嚴重。Pearson相關分析顯示RA患者關節液miR-146 a表達水平與RF數值和DAS 28評分呈正相關。提示關節液miR-146 a水平能夠反映RA疾病活動性，能夠作為RA疾病活動性的標志物。進一步采用ROC曲線分析關節液miR-146 a水平對RA的診斷效能。結果顯示, miR-146 a曲線下面積(AUC)為0.71(P<0.01); 關節液miR-146 a預測RA的靈敏度為85.29%, 特異度為61.54%。

綜上所述，針對RA患者關節液中miRNAs的研究有助于了解RA的發病機制。通過對關節液中RA特異性miRNA檢測，有利于早期診斷RA, 并且對RA疾病嚴重程度和活動性進行評估。

[1] Carmona L, Cross M, Williams B, et al. Rheumatoid arthritis[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol, 2010, 24(6): 733-745.

[2] Huang Y, Shen X J, Zou Q, et al. Biological functions of microRNAs[J]. Bioorg Khim, 2010, 36(6): 747-752.

[3] Mizoguchi F, Kohsaka H. Role of microRNA in rheumatoid arthritis[J]. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, 2012, 35(1): 69-74.

[4] Chatzikyriakidou A, Voulgari P V, Georgiou I, et al. miRNAs and related polymorphisms in rheumatoid arthritis susceptibility[J]. Autoimmun Rev, 2012, 11(9): 636-641.

[5] Langenegger T, Fransen J, Forster A, et al. Clinical quality management in rheumatoid arthritis[J]. Z Rheumatol, 2001, 60(5): 333-341.

[6] Wiklund E D, Kjems J, Clark S J. Epigenetic architecture and miRNA: reciprocal regulators[J]. Epigenomics, 2010, 2(6): 823-840.

[7] Balanescu S, Calmac L, Constantinescu D, et al. Systemic inflammation and early atheroma formation: are they related？[J]. Maedica (Buchar), 2010, 5(4): 292-301.

[8] Stanczyk J, Pedrioli D M, Brentano F, et al. Altered expression of MicroRNA in synovial fibroblasts and synovial tissue in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(4): 1001-1009.

[9] 鄭錫銘, 劉鑫, 周林林, 等. 6種miRNAs在類風濕關節炎患者外周血及關節液中的表達分析[J]. 中國免疫學雜志, 2014(12): 1686-1691.

[10] Weber J A, Baxter D H, Zhang S, et al. The microRNA spectrum in 12 body fluids[J]. Clin Chem, 2010, 56(11): 1733-1741.

[11] Cuellar J M, Scuderi G J, Cuellar V G, et al. Diagnostic utility of cytokine biomarkers in the evaluation of acute knee pain[J]. J Bone Joint Surg Am, 2009, 91(10): 2313-2320.

[12] Xie W Q, Tan S Y, Wang X F. MiR-146a rs2910164 polymorphism increases risk of gastric cancer: a meta-analysis[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(41): 15440-15447.

[13] Saba R, Sorensen D L, Booth S A. MicroRNA-146a: A Dominant, Negative Regulator of the Innate Immune Response[J]. Front Immunol, 2014, 5: 578-83.

[14] Park H, Huang X, Lu C, et al. MicroRNA-146a and microRNA-146b regulate human dendritic cell apoptosis and cytokine production by targeting TRAF6 and IRAK1 proteins[J]. J Biol Chem, 2015, 290(5): 2831-2841.

[15] Nakasa T, Miyaki S, Okubo A, et al. Expression of microRNA-146 in rheumatoid arthritis synovial tissue[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(5): 1284-1292.

Gene expression profile of miRNA in joint fluids of patients with rheumatoid arthritis and its clinical significance

LI Li1, LUO Xiaoxing2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory; 2.CadreWard,The458thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Guangzhou,Guangdong, 510062)

Objective To detect the gene expression profiles of miRNA in joint fluids of patients with rheumatoid arthritis (RA) and healthy people and clinical significance. Methods The expressions of miRNAs in joint fluids of 3 RA patients and 3 healthy adults were detected by miRNA chip technology, and miRNAs with significant differential expressions were selected to be validated by the qRT-PCR. Correlations between selected miRNA and clinical and laboratory indexes of RA were analyzed. Results In the gene expression profile of miRNA in joint fluids of patients with RA, the expressions of 23 miRNAs significantly changed when compared with those in the healthy people. The results of selected miRNAs by qRT-PCR were correspond with the Results of the miRNA chip technology. The difference of miR-146a expression in joint fluid between RA patients and healthy controls was the most significant. Pearson correlation analysis showed that serum miR-146a expression in joint fluid of RA patients was positively correlated with rheumatoid factor (RF) value and DAS28 score. ROC curve analysis showed that the area under the curve (AUC) of miR-146a was 0.71, and the sensitivity and the specificity of miR-146a in joint fluid in predicting RA were 85.29% and 61.54% respectively. Conclusion There is significant difference in expression of miRNAs in joint fluid between RA patients and healthy people. Expression of miR-146a increases significantly in joint fluid of RA patients, and it level is significantly correlated with the clinical and laboratory indexes of RA.

rheumatoid arthritis; miRNA chip; joint fluid; miR-146a

2017-03-14

R 593.22

A

1672-2353(2017)13-051-05

10.7619/jcmp.201713014