復方酸棗仁顆粒質量標準研究

吳瓊　胡北　李想

[摘要] 目的 對復方酸棗仁顆粒的質量標準進行研究。 方法 采用薄層色譜法（TLC）對制劑中的酸棗仁、知母、甘草三味藥材進行專屬性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）對處方中藥材知母的有效成分芒果苷進行含量測定。色譜柱為Welchrom C18 HPLC Column（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86），檢測波長為258 nm，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃。 結果 酸棗仁、知母、甘草三味藥材的TLC特征斑點清晰，分離度好，陰性沒有干擾。芒果苷在1.072～167.5 μg/mL的濃度范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為Y=42 888X-30 400，r = 0.999 9。平均加樣回收率為99.15%，RSD=2.82%（n = 6）。3批樣品中芒果苷的含量分別為0.1690、0.2473、0.2735 mg/g，符合要求。 結論 所建立的質量標準準確、重復性良好，可用于復方酸棗仁顆粒的質量控制。

[關鍵詞] 復方酸棗仁顆粒；芒果苷；高效液相色譜法；薄層色譜法；質量控制

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（c）-0144-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard for Fufang Suanzaoren Granules. Methods Ziziphi spinosae semen， Anemarrhenae rhizome， Glycyrrhizae radix et rhizoma were identified by TLC. The contents of mangiferin were determined by HPLC. HPLC method on mangiferin was adopted on a Welchrom C18 （4.6 mm×200 mm， 5 μm） column with Methanol-acetonitrile-0.5% acetic acid （7∶7∶86） as the mobile phase， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 258 nm， the column temperature was 30℃ and the injection volum was 10 μL. Results TLC spots of Ziziphi spinosae semen， Anemarrhenae rhizome， Glycyrrhizae radix et rhizoma were clear with good resolution and without interference of negative samples. There was a good linearity within the range of 1.072-167.5 μg/mL， with the linear equation of Y=42 888X-30 400， r = 0.999 9. The average recovery of berberine hydrochloride was 99.15% and the RSD was 2.82% （n = 6）. The content of Mangiferin in three batchs samples were satisfactory. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It can be used as the quality control method of Fufang Suanzaoren Granules.

[Key words] Fufang Suanzaoren Granules； Mangiferin； HPLC； TLC； Quality standard

復方酸棗仁顆粒含有川芎、知母、酸棗仁、甘草、茯苓五味中藥，具有養肝血，安心神，調血養肝，清熱除煩的功效，用于治療虛勞煩不得眠、心悸、盜汗、頭暈目眩、咽干口燥、脈弦或細數所致的心煩失眠等癥，臨床應用中療效確切，效果較好。復方酸棗仁顆粒是由沈陽軍區總醫院（以下簡稱“我院”）生產的，根據總后勤部衛生部下發的“軍隊醫療機構制劑標準提高計劃”中對醫院制劑標準研究項目的提高的要求，對復方酸棗仁顆粒的質量標準進行了再提高和進一步完善[1]。復方酸棗仁顆粒中的知母是我國傳統的中藥材，性苦、甘、寒，有清熱瀉火，滋陰潤燥之功效[2]。復方酸棗仁顆粒的原制劑質量標準中沒有含量測定項，為了提高制劑的質量，應用薄層色譜法（TLC）對復方酸棗仁顆粒中的酸棗仁、知母、甘草三味藥材展開了專屬性鑒別，同時應用高效液相色譜法（HPLC）測定了知母的有效成分芒果苷的含量。

1 儀器與試藥

AUW120D型分析天平（日本島津公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率150 W，頻率40 kHz）；W600型Waters高效液相色譜儀（2996型紫外檢測器）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）；芒果苷對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，供含量測定用，批號為：111607-201503）；甘草苷對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號為：111610-201106）；知母對照藥材（中國藥品生物制品檢定研究院，批號為：1070-200002）；酸棗仁對照藥材（中國藥品生物制品檢定研究院，批號為：121517-201103）；復方酸棗仁顆粒（我院，批號分別為：20151008、20151212、20151215）；自制的知母、酸棗仁、甘草陰性樣品各1批；乙醇（沈陽市蘇家屯區遼河化工廠）；甲醇（色譜純，Fisher公司）；乙腈（色譜純，Sigma公司）；乙酸（天津市恒興化學試劑制造有限公司）；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別實驗

2.1.1 酸棗仁藥材的薄層色譜鑒別 取復方酸棗仁顆粒20 g，研細，置圓底燒瓶中，加甲醇100 mL，加熱回流1 h，將其濾過，并將其濾液蒸干，殘渣加水15 mL使之溶解，之后用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15 mL，合并正丁醇提取液，用氨水洗滌2次，每次用量10 mL，并將洗液棄去，將正丁醇液用水浴蒸干，用1 mL甲醇溶解殘渣，將此溶液作為復方酸棗仁顆粒的供試品溶液[2-6]。另取酸棗仁對照藥材2 g，加入甲醇30 mL，依供試品溶液制法制成對照藥材溶液[2-6]。照TLC試驗，吸取上述供試品溶液及對照藥材溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）的上層為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置于105℃加熱至斑點清晰[7-8]。供試品色譜中，在與酸棗仁對照藥材色譜相應的位置上，顯示相同顏色的斑點；在陰性樣品色譜中于相應的位置上無干擾（圖1）。

2.1.2 知母薄層鑒別 取本品8 g，研細，置圓底燒瓶中，加乙醇40 mL，鹽酸1 mL，加熱回流1.5 h，放冷，濾過，取續濾液，加水10 mL，加甲苯振搖提取2次，每次20 mL，過濾后合并甲苯溶液，將其水浴蒸干，加入1 mL甲醇溶解殘渣，將此溶液作為復方酸棗仁顆粒的供試品溶液[2-3]。另取知母對照藥材0.5 g，同供試品溶液制法制成對照藥材溶液。照TLC試驗，吸取上述供試品溶液及對照藥材溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-丙酮（7∶3）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，置于105℃加熱至斑點清晰[9-10]。供試品色譜中，在與知母對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在陰性對照樣品色譜中于相應的位置上無干擾（圖2）。

2.1.3 甘草薄層鑒別 取復方酸棗仁顆粒16 g，研細，加入甲醇30 mL，超聲處理40 min，濾過，將濾液置于水浴蒸干，加入1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取甘草苷對照品，加甲醇，制成1 mg/mL的甘草苷溶液，作為對照品溶液[2-3]。照TLC試驗，吸取上述供試品溶液及對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水（10∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，置于105℃加熱至斑點清晰[11-12]。供試品色譜中，在與對照品相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在陰性樣品色譜中于相應的位置上無干擾（圖3）。

2.2 芒果苷含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Welchrom C18（4.6 mm×200 mm， 5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為258 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。理論塔板數按芒果苷計算應不低于3000[2-3，13-16]。

2.2.2 對照品溶液的制備 取適量芒果苷對照品，精密稱定，加入流動相使溶解，制成每毫升含芒果苷10 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液及陰性供試品溶液的制備 取復方酸棗仁顆粒，研細，取約5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL的70%乙醇，密塞后，稱定其重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定其重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻后，濾過，量取續濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相溶液稀釋至刻度，搖勻，即得[17-18]。

另取缺少知母的陰性樣品顆粒，按供試品溶液制備的處理方法進行處理，制得陰性樣品溶液。進樣前經0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.2.4 專屬性試驗 取“2.2”項下3種溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行進樣測定。精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10 μL，于高效液相色譜儀中測定。結果見圖4，芒果苷的保留時間約為24 min，陰性樣品不干擾芒果苷的方法測定，芒果苷與其他的雜質或成分的分離度>1.5，理論塔板數按芒果苷計算應不低于3000。試驗結果表明此方法專屬性強。

2.2.5 線性關系考察 精密吸取濃度分別為1.072、3.216、10.72、42.880、167.500 μg/mL的芒果苷對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，按“2.2.1”色譜條件分析，測定各對照品的峰面積，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標，以峰面積值為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程為：Y=42 888X-30 400，r = 0.999 9。結果表明，芒果苷在1.072～167.5 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液（10 μg/mL）10 μL，連續進針6次進行測定，記錄各個色譜峰的峰面積，測得芒果苷峰面積的RSD為1.37%（n = 6）。結果表明，儀器的精密度符合要求。

2.2.7 穩定性試驗 取同一批復方酸棗仁顆粒樣品（批號：20151212），研細，取約5 g，精密稱定，按照“2.2.3”供試品溶液制備的方法進行操作，按“2.2.1”項下的色譜條件進行分析，分別在0、2、4、6、8、10 h進樣，測定樣品中不同時間段芒果苷的色譜峰峰面積，測得芒果苷峰面積的RSD為2.23%（n = 6）。說明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取同一批顆粒樣品（批號：20151212），研細，取約5 g，對其精密稱定，按照“2.2.3”供試品溶液制備的方法進行操作，按“2.2.1”項下的色譜條件進行分析，測定每份供試樣品中芒果苷的含量[17-18]。結果顯示樣品中芒果苷的平均含量為0.2581 mg/g，RSD為2.34%（n = 6）。結果表明，本方法的重復性良好，符合要求。

2.2.9 加樣回收率試驗 取同一批酸棗仁顆粒樣品（批號：20151211），研細，取約2.5 g（共6份），精密稱定，分別精密加入芒果苷對照品溶液（0.67 mg/mL）1.0 mL，按照“2.2.3”項下供試品溶液制備的方法進行操作，制成供測定回收率用的供試品溶液[17-20]，按“2.2.1”項下的色譜條件分析，測定樣品中芒果苷含量，計算加樣回收率，結果該樣品中芒果苷的平均回收率為99.15%，RSD為2.82%（n = 6）；結果表明，本方法回收率較高。結果見表1。

2.2.10 樣品含量測定 取3個批號的復方酸棗仁顆粒樣品（批號：20151008、20151212、20151215），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測定樣品中芒果苷的含量，結果見表2。結果3批樣品芒果苷的含量分別為0.1690、0.2473、0.2735 mg/g。

3 討論

3.1 薄層鑒別

本實驗中對酸棗仁鑒別所采用的TLC展開劑參考《中國藥典》2015年版酸棗仁鑒別項下的相關條件，最終采用正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）的上層為展開劑進行展開，結果斑點清晰、陰性無干擾[2-6]。

3.2 含量測定

處方中君藥為酸棗仁，依照《中國藥典》2015年版一部中規定，選取酸棗仁皂苷A作為含量測定項，但試驗過程中發現，酸棗仁皂苷A含量過低，實驗條件下無法實現待測物質峰的良好分離。故選擇對知母中有效成分芒果苷進行含量測定。

參考《中國藥典》芒果苷的含量測定項下流動相的選擇，選用甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（10∶5∶85）、甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（8∶8∶84）、甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）為流動相作為試驗條件進行了考察，待測樣品與雜質不能完全分離，陰性樣品有干擾，進而調整流動相的比例，最終選擇了甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）為流動相，待測樣品可與雜質可完全分離，陰性樣品沒有干擾，并取得了較好的峰形和較高的理論塔板數，效果良好[2]。

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（收稿日期：2017-01-30 本文編輯：李亞聰）