大鼠肺缺血再灌注損傷模型中TLR4信號通路介導(dǎo)HIF—1α的變化及其意義

才開·莎熱麗　徐思成　李超

[摘要] 目的 探討大鼠肺缺血再灌注損傷（IRI）模型中Toll樣受體4（TLR4）信號通路介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的變化及其意義。 方法 選取48只健康雄性SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、IRI模型組、TLR4激活組（脂多糖干預(yù)）、TLR4抑制組（TAK-242干預(yù)），每組各12只大鼠。造模前3周時，IRI模型組和假手術(shù)組靜脈注射生理鹽水，TLR4激活組靜脈注射脂多糖，TLR4抑制組靜脈注射TAK-242，每周1次，連續(xù)3周。IRI模型組、TLR4激活組和TLR4抑制組均于末次注射30 min后建立肺缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組除不阻斷肺門外，其他操作方法同前。再灌注損傷后3 h采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）檢測各組大鼠肺組織中Toll樣受體4（TLR4）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）mRNA表達，采用免疫印跡法（Western-blot）檢測各組大鼠肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6蛋白表達水平。 結(jié)果 肺濕重/干重值IRI模型組高于假手術(shù)組（P < 0.05），TLR4激活組高于IRI模型組（P < 0.05），TLR4抑制組低于IRI模型組（P < 0.05）；肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表達水平IRI模型組高于假手術(shù)組（P < 0.05），TLR4激活組高于IRI模型組（P < 0.05），TLR4抑制組低于IRI模型組（P < 0.05）。 結(jié)論 大鼠肺IRI后，肺組織中TLR4信號通路介導(dǎo)HIF-1α的水平顯著升高，會增加對肺組織的炎癥損傷程度。

[關(guān)鍵詞] 肺缺血再灌注損傷；Toll樣受體4；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（c）-0018-05

[Abstract] Objective To investigate the changes and significance of hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） mediated by Toll like receptor 4 （TLR4） signal pathway in the model of lung ischemia reperfusion injury （IRI） rats. Methods A total of 48 healthy male SD rats were selected and randomly divided into sham operation group， IRI model group， TLR4 activation group （LPS intervention） and TLR4 inhibition group （TAK-242 intervention） with 12 rats in each group. 3 weeks before model， IRI model group and sham operation group were injected with saline， TLR4 activation group was injected with lipopolysaccharide， TLR4 inhibition group was injected with TAK-242， once a week for three weeks. IRI model group， TLR4 activation group and TLR4 inhibition group were established a model of lung ischemia-reperfusion injury after last injection 30 minutes， sham operation group was treated same as the other groups except for not block the lung door. 3 hours after reperfusion injury， TLR4， HIF-1α， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） mRNA expression of lung tissue were tested by reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR）. TLR4， HIF-1α， TNF-α and IL-6 protein expression of lung tissue were tested by Western-blot. Results The lung wet weight/dry weight ratio of the IRI model group was higher than that of the sham operation group （P < 0.05）， the TLR4 activation group was higher than that of the model group （P < 0.05）， and the TLR4 inhibition group was lower than that of the model group （P < 0.05）. The mRNA and protein expression levels of TLR4， HIF-1α， TNF-α， IL-6 in the lung tissues of IRI model group were higher than those of the sham operation group （P < 0.05）， the TLR4 activation were higher than those of the model group （P < 0.05）， and the TLR4 inhibition group were lower than those of the model group （P < 0.05）. Conclusion The TLR4 signal pathway in the lung tissue mediates the HIF-1α expression increased significantly after lung ischemia-reperfusion injury in rats， and increases the degree of inflammatory damage to the lung tissue.

[Key words] Ischemia reperfusion injury of lung； Toll like receptor 4； Hypoxia inducible factor-1α

肺缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是臨床心肺術(shù)后較為常見的并發(fā)癥之一，其可誘發(fā)一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)并導(dǎo)致肺損傷，嚴重影響患者的預(yù)后效果[1-3]。研究表明，IRI的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的病理過程，涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自由基產(chǎn)生、促炎介質(zhì)釋放等過程[4]。而局部炎性反應(yīng)又可誘發(fā)全身性炎性反應(yīng)甚至是器官衰竭的發(fā)生，最終可導(dǎo)致死亡[5-8]。Toll樣受體4（TLR4）信號通路被認為是炎性反應(yīng)的重要信號因子，而缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是缺氧的信號因子之一，且二者之間具有相互調(diào)控機制，可進一步導(dǎo)致促炎性反應(yīng)的發(fā)生，進而參與IRI的發(fā)生和發(fā)展[9]。為此，本研究探討分析了大鼠肺IRI模型中TLR4信號通路介導(dǎo)HIF-1α的變化及意義，為臨床上尋求新的治療靶點提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取48只健康雄性SD大鼠，均為SPF級，4～6周齡，體重250～300 g，平均（278.9±10.3）g，購買于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心（動物合格證號：XJYKDX-20160317002），喂養(yǎng)于光照12 h、相對濕度45%～60%、溫度23～25℃的實驗室中。

1.2 藥品、儀器

TAK-242、戊巴比妥鈉、脂多糖、辣根過氧化物酶（HRP）均購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自美國Epitomics公司；單克隆兔抗TLR4、單克隆兔抗HIF-1α、單克隆兔抗TNF-α、單克隆兔抗IL-6均購自美國Epitomics公司；TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6引物均購自上海生工生物工程有限公司。

動物呼吸機購自北京眾實迪創(chuàng)科技公司，電泳槽購自美國Bio-Rad公司，RT-PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 分組與造模

將48只大鼠隨機分成四組，即假手術(shù)組、IRI模型組、TLR4激活組和TLR4抑制組，每組各12只。其中，IRI模型組和假手術(shù)組于造模前3周靜脈注射2 mL生理鹽水，TLR4激活組于造模前3周靜脈注射脂多糖（1.50 mg溶于2 mL生理鹽水），TLR4抑制組于造模前3周靜脈注射TLR4特異性抑制劑TAK-242（10 mg/kg溶于2 mL DMSO）進行干預(yù)，每周1次，連續(xù)3周。IRI模型組、TLR4激活組和TLR4抑制組均于末次注射30 min后建立肺缺血再灌注損傷模型，方法如下：大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，同時皮下注射肝素1000 U/kg，經(jīng)口氣管插管后接動物呼吸機，通氣頻率為70次/min，潮氣量為10 mL/kg。在大鼠左側(cè)第五肋間做長約3 cm的切口，切開胸廓后暴露左肺門，待大鼠吸氣時完全阻斷左肺門，45 min后恢復(fù)血流灌注，3 h時完整切取左肺。假手術(shù)組除不阻斷肺門外，其他操作方法同前。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 肺組織濕重/干重值檢測 取部分左肺組織稱量濕重，隨后將其置于65℃烤箱中72 h，稱量干重后計算左肺濕重與干重比值。

1.4.2 RT-PCR檢測 取部分肺組織采用RNA提取試劑盒提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為DNA，在聚合酶的作用下進行擴增。引物如下：TLR4上游：GTTCATCTGCTTTCTGCTG，下游：TGATTCTGCCTGA-TGTTGC；HIF-1α上游：GTTTACTAAAGGACAAGTCACC，下游：TTCTGTTTGTTGAAGCAG；IL-6上游：ACTGCCTTCCCTACTTCACA，下游：TCGCTGTTCATACAATCAGA；TNF-α上游：AATCAGCCTCCCTCAT-CAGTT；下游：CCACTTGGTGGTTTGCTACGA；β-actin上游：GCCATGTACGTAGCCATCCA，下游：GAACCGCT-CATTGCCGATAG。擴增條件如下：95℃ 10 min，然后以95℃ 15 s、60℃ 60 s為1個循環(huán)，共進行40個循環(huán)。具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。電泳后得到目的條帶的光密度值與β-actin光密度值進行比較，最終得出TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平。

1.4.3 Western-blot檢測 取大鼠肺組織制備蛋白樣，并取約75 μg以10%十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，分離后轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；加入一抗（TLR4、TNF-α、IL-6和HIF-1α）后4℃孵育過夜，以0.5%TBS-T溶液洗膜3次后再加入HRP標記的二抗進行反應(yīng)，以0.5%TBS-T溶液洗膜3次用化學(xué)發(fā)光法進行顯色，并采用軟件進行灰度值分析，計算各目標蛋白與β-actin的灰度比值。

1.4.4 HE染色 取各組大鼠部分新鮮肺組織，以4%中性甲醛溶液固定后做連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后進行病理檢測，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)觀察

圖1為各組大鼠肺組織HE染色后100倍光鏡下觀察，假手術(shù)組肺組織未見明顯異常，肺泡組織結(jié)構(gòu)清楚，僅見極少量紅細胞及炎癥細胞浸潤于肺泡腔；B為IRI模型組可見肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隙增寬，肺毛細血管充血明顯，肺泡腔內(nèi)大量的紅細胞，炎性細胞浸潤；TRL4激活組可見大鼠肺組織病變程度較IRI模型組更加嚴重；TRL4抑制組可見大鼠肺組織中的病變程度較IRI模型組輕微。

2.2 各組大鼠肺濕重/干重值比較

IRI模型組肺濕重/干重值高于假手術(shù)組，TLR4激活組肺濕重/干重值高于IRI模型組，TLR4抑制組肺濕重/干重值低于IRI模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平比較

IRI模型組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平均高于假手術(shù)組，TLR4激活組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平高于IRI模型組，TLR4抑制組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平低于IRI模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達水平比較

IRI模型組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達水平高于假手術(shù)組，TLR4激活組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達水平高于IRI模型組，TLR4抑制組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達水平低于IRI模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表3、圖2。

3 討論

肺IRI是一種較為復(fù)雜的病理、生理過程，多在肺移植、體外循環(huán)、肺袖式切除、肺動脈成形、肺動脈血栓內(nèi)膜剝脫、心肺復(fù)蘇及創(chuàng)傷等情況下發(fā)生，患者表現(xiàn)多為肺水腫、肺血管阻力增加、微循環(huán)通透性增加、肺動脈高壓等，嚴重時甚至導(dǎo)致死亡[10-12]。研究表明，肺缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展與炎癥介質(zhì)釋放、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞內(nèi)轉(zhuǎn)超載、細胞死亡誘導(dǎo)、中性粒細胞活化以及保護性介質(zhì)的減少等因素有關(guān)[13-14]，其中，炎性反應(yīng)和缺氧在這一過程中發(fā)揮了重要的作用。有研究表明，炎癥和缺氧可以協(xié)同作用，炎癥環(huán)境會導(dǎo)致氧含量持續(xù)下降，而細胞耗氧量的增加又會導(dǎo)致炎性反應(yīng)和組織損傷的加劇，進而促進缺血再灌注損傷的發(fā)展[15-16]，但是具體機制目前尚不完全清楚，可能與TLR4信號通路介導(dǎo)HIF-1α的變化有關(guān)。因此，本研究將大鼠分別靜脈注射脂多糖、TAK-242和生理鹽水干預(yù)后再建立肺缺血再灌注損傷，并對各組再灌注損傷后3 h的相關(guān)實驗室指標進行了分析比較。

本研究發(fā)現(xiàn)，建立灌注模型后，IRI模型組大鼠病理檢測發(fā)現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，炎性反應(yīng)較為明顯，TRL4激活組大鼠的肺組織病變程度較IRI模型組更加嚴重，而TRL4抑制組大鼠肺組織中的病變程度較IRI模型組輕微；IRI模型組大鼠肺濕重/干重值高于假手術(shù)組，TLR4激活組肺濕重/干重值高于IRI模型組，而TLR4抑制組肺濕重/干重值低于IRI模型組，上述結(jié)果提示肺缺血再灌注模型建立成功。TRL4激活組添加脂多糖后大鼠肺部可見明顯炎性反應(yīng)，且肺濕重/干重值明顯偏高，而TLR4抑制組添加TRL4抑制劑后炎性反應(yīng)明顯降低，進一步說明TRL4在肺缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，但其具體機制仍需做進一步深入研究。

本研究利用RT-PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)分別對各組大鼠肺組織中TLR4、HIF-1α mRNA和蛋白水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，IRI模型組大鼠肺組織mRNA和蛋白水平均明顯高于假手術(shù)組，而TLR4激活組較IRI模型組更高，TLR4抑制組mRNA和蛋白水平均明顯低于IRI模型組，提示脂多糖能明顯激活TLR4通道，促進TLR4的分泌和相關(guān)蛋白的表達，而利用TLR4特異性抑制劑將TLR4通道抑制后可明顯降低TLR4、HIF-1α mRNA及蛋白表達水平。

HIF-1α是一種重要的缺氧相關(guān)調(diào)節(jié)因子，其可與下游的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合后調(diào)控下游基因的激活，而HIF-1α與TLR4之間也存在著密切聯(lián)系[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，特異性TLR4配脂多糖干預(yù)后可明顯促進HIF-1α的累積及活化，并能抑制HIF-1α蛋白的降解，說明IRI中缺氧及TLR4激活可協(xié)同作用，增加HIF-1α的累積及活化，二者在大鼠肺缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用，但具體機制仍需做更深入研究。

本研究利用RT-PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)分別對各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，IRI模型組mRNA和蛋白水平均高于假手術(shù)組，而TLR4激活組更高，但TLR4抑制組mRNA和蛋白水平均明顯低于IRI模型組。TNF-α和IL-6作為促炎癥因子均可以誘導(dǎo)中性粒細胞趨化和其他炎癥因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致缺血再灌注損傷的發(fā)生[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4可上調(diào)TNF-α和IL-6等炎癥因子水平，促進炎性反應(yīng)的發(fā)展，進而導(dǎo)致缺血再灌注損傷的加重。同時也表明，HIF-1α在TLR4信號通路介導(dǎo)的肺IRI中發(fā)揮著重要作用，其可上調(diào)繼發(fā)性損傷性因子等因素，促進細胞凋亡及炎性反應(yīng)；而抑制TLR4激活通道后可明顯抑制HIF-1α的活性，進而降低各項炎癥因子水平，但能否將抑制HIF-1α的活性作為一種新的治療靶點仍需做進一步的深入研究。

本研究采用不同方式干預(yù)處理后制作大鼠肺IRI模型并檢測各項指標發(fā)現(xiàn)，脂多糖激活TLR4后可促進缺氧因子HIF-1α的分泌和表達，并能上調(diào)炎癥因子水平，促進炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，進而導(dǎo)致肺IRI加重，這與相關(guān)文獻的結(jié)果基本一致[20]。但本研究限于研究樣本量不足，對于TLR4信號通路介導(dǎo)HIF-1α水平變化的具體機制仍需進一步深入研究。

綜上所述，大鼠肺IRI后肺組織中TLR4信號通路介導(dǎo)HIF-1α水平顯著升高，從而增加對肺組織的炎癥損傷程度。

[參考文獻]

[1] 麻日虎，李瑩，王玉旋，等.“漸處理”對肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9（35）：38-40.

[2] Chen TH，Liao FT，Yang YC，et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury - induced acute renal injury [J]. Transplantation Proceedings，2014，46（4）：1123-1126.

[3] Xie CL，Li JH，Wang WW，et al. Neuroprotective effect of ginsenoside-Rg1 on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats by downregulating protease-activated receptor-1 expression [J]. Life Sciences，2015，121（8）：145-151.

[4] 倪金鳳，高長俊，郝冬榮，等.血清炎癥因子在評估兒童社區(qū)獲得性肺炎病情嚴重程度中的臨床價值[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（4）：69-72

[5] 鄭志雄，彭雪梅，席露，等.乳化氟碳聯(lián)合川芎嗪對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，36（2）：250-254.

[6] 劉雪峰.山楂葉總黃酮對肺缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25（3）：257-260.

[7] 曹騰波.迷走神經(jīng)電刺激對肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].上海醫(yī)學(xué)，2016，39（4）：229-232.

[8] 張自珍，羅欣，于小華.黃芪注射液抑制壓瘡缺血再灌注損傷大鼠的炎癥反應(yīng)并增強其抗氧化損傷能力[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（4）：507-510.

[9] 梁桂娟，王迎濤，唐成和，等.Toll樣受體4在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中的表達變化[J].中國新生兒科雜志，2016，31（3）：222-225.

[10] Yue S，Rao J，Zhu J，et al. Myeloid PTEN Deficiency Protects Livers from Ischemia Reperfusion Injury by Facilitating M2 Macrophage Differentiation [J]. J Immunol，2014， 192（11）：5343-5353.

[11] Ibánez B，Heusch G，Ovize M，et al. Evolving Therapies for Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury [J]. J Am CollCardiol，2015，65（14）：1454-1471.

[12] 劉春全，楊雷，張臨友.肺移植缺血再灌注損傷免疫途徑及其保護措施的研究現(xiàn)狀[J].國際免疫學(xué)雜志，2015， 38（3）：115-117.

[13] 張敬強，司裕龍，郭亞雄.FTY720對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國藥物與臨床，2014，14（8）：1032-1034.

[14] 劉建平，何建峰.黃芪甲苷對大鼠肺缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響[J].江蘇中醫(yī)藥，2016，48（6）：75-78.

[15] 謝元輝，黃益素，喻依川，等.炎癥缺血缺氧損傷對體外培養(yǎng)的大腦皮層星形膠質(zhì)細胞中內(nèi)皮性脂酶表達的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2014，30（3）：363-366.

[16] 孫經(jīng)武，王艷艷，房燦.藏紅花酸預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的影響及其機制[J].中國循環(huán)雜志，2015，30（2）：172-175.

[17] 楊夢思，周娜，王志鋼，等.轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α及其信號通路在疾病發(fā)生中的作用研究進展[J].生物技術(shù)通報，2016，32（8）：123-125.

[18] 解德瓊，張臣麗，吳婭琳，等.蛇床子素預(yù)處理對腎臟缺血再灌注損傷炎癥因子表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2015，16（2）：102-105.

[19] 吳珍妮，胡滿燕，龍子江，等.欣怡膠囊對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎癥因子及心臟組織形態(tài)的影響[J].中成藥，2015，37（11）：2342-2346.

[20] 周志毅，朱幸沨，陳靜瑜，等.缺氧誘導(dǎo)因子-1α在TLR4信號通路介導(dǎo)的大鼠肺缺血再灌注損傷中的影響[J].中華器官移植雜志，2014，35（9）：561-566.

（收稿日期：2016-11-17 本文編輯：程 銘）