化橘紅對糖尿病心肌病心肌細胞TGF-β1/Smad信號通路的干預作用

楊 澄，劉歷威肇慶醫學高等專科學校內科，廣東 肇慶 56060；南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 508

化橘紅對糖尿病心肌病心肌細胞TGF-β1/Smad信號通路的干預作用

楊 澄1，劉歷威21肇慶醫學高等專科學校內科，廣東 肇慶 526060；2南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510282

目的觀察化橘紅對糖尿病心肌病（DCM）大鼠心肌細胞TGF-β1/Smad信號通路的干預作用。方法（1）構建DCM大鼠模型，將40只大鼠用鏈脈佐菌素處理后，15只血糖濃度＜16.7 mmol/L的大鼠納入空白對照組，剩余的25只血糖濃度＞16.7 mmol/L的大鼠隨機分為DCM組（n=11）與化橘紅組（n=14）。化橘紅組大鼠給予化橘紅400 mg/(kg·d)灌胃，DCM組和對照組給予等量生理鹽水灌胃。測量各組大鼠不同時間點血糖（1、8、16、22周）；測量心功能相關指標；光鏡下觀察心肌形態學改變，電鏡下心肌纖維化定量分析；測定心肌膠原總量；免疫組化測定心肌膠原；Western印跡檢測心肌細胞TGF-β1、Smad、MMP-9、MMP-2、TIMP-1等蛋白含量；RT-PCR檢測TGF-β1、MMP-9、MMP-2、TIMP-1等蛋白的mRNA表達。（2）構建心肌成纖維細胞增殖模型，隨機分為兩組，化橘紅預處理組為血清培養基加0.5 mmol/L化橘紅，而對照組為等量血清培養基。檢測兩組一氧化氮變化、TGF-β1蛋白、c-fos蛋白、p27蛋白，iNOS蛋白、Cyclin D蛋白表達情況。結果化橘紅組的大鼠各時間點血糖、心肌纖維化、心肌膠原總量及各型膠原較DCM組顯著下降，心收縮、舒張功能明顯改善（P＜0.05），TGF-β1、Smad、MMP-9、MMP-2、TIMP-1蛋白的表達明顯下調（P＜0.05），相關蛋白的mRNA表達也明顯抑制（P＜0.05）。化橘紅預處理組一氧化氮、TGF-β1蛋白、cfos蛋白、p27蛋白，iNOS蛋白、Cyclin D蛋白表達情況較對照組相比明顯下降（P＜0.05）。結論化橘紅對DCM中TGF-β1/Smad通路起到了抑制作用，從而調控其下游的MMPs/TIMPs等通路，改善DCM的心肌纖維化進程，抑制心肌肥厚，減少心肌的損傷。

化橘紅；糖尿病心肌病；TGF-β1；Smad

糖尿病心肌病（DCM）是一種獨立的糖尿病心血管并發癥[1]，與糖尿病患者的高心力衰竭發生率和高死亡率密切相關。現已明確參與糖尿病心肌纖維化的調控因素有腎素-血管緊張素-醛固酮系統、內皮素、一氧化氮、糖基化終末產物、基質金屬蛋白酶（MMPs）、TGF-β1等[2]。化橘紅是我國廣東化州特有的藥材[3]，其中柚皮苷是其主要成分，國內外多項研究顯示了化橘紅對DCM大鼠有積極影響。Jung等[4]發現化橘紅能有效改善DCM大鼠的糖脂代謝，梁建光等[5]研究發現化橘紅通過調節NF-κB通路對DCM大鼠起到心肌保護作用。TGF-β1/Smad作為DCM形成的關鍵通路，化橘紅對其作用少有報道。作者通過建立DCM動物模型和心肌成纖維細胞增殖模型，旨在觀察化橘紅對DCM心肌細胞TGF-β1/Smad信號通路的干預作用以及心肌間質纖維化以及心功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wister大鼠40只，雄性，體質量250～300 g（合格證號體粵2006-0015）。飼養條件為恒溫24±2 ℃，飼養環境符合實驗動物環境設施要求。

1.2 主要試劑與藥物

試劑：化橘紅藥液（濃度100%）；鏈脲佐菌素；羥脯氨酸標準品（購自北京鼎國生物技術發展中心）。濃縮型I型膠原一抗、濃縮型Ⅲ型膠原一抗、濃縮型TGF-β1一抗（均購自武漢博士德生物工程有限公司）；多聚賴氨酸，PBS緩沖液, DAB顯色試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司ED1022）。

儀器：MA110型電子分析天平（上海第二天平儀器廠生產），BIOFUGE13型臺式高速離心機（美國BERRA），UV-1206型分光光度計（德國ZAISS），顯微圖象分析儀（MetaMorph/DP10/BX51型-美國通用圖象公司），數碼照相機（Olympus），顯微鏡（BX51, 日本）。

1.3 方法

1.3.1 模型的建立與標本采集

1.3.1.1 DCM模型的建立與標本采集 雄性大鼠40只室溫飼養，標準飼料。正常飼養1周后，禁食12 h，將鏈脈佐菌素用0.1 mmol/L、pH4.2的檸檬酸緩沖液新鮮配制，參照張春虹等的方法按55 mg/kg腹腔注射，后予5%葡萄糖溶液進水，48 h后換用自來水飲用。大鼠繼續原飼料喂養12周后（自鏈脈佐菌素注射起），將血糖＞16.7 mmol/L且具有多飲、多食、多尿的大鼠25只納入實驗組，其余列為空白對照組。將納入實驗組的大鼠隨機分為DCM組、化橘紅組。化橘紅組大鼠給予化橘紅400 mg/（kg·d）灌胃，DCM組和空白對照組（NC組）給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠繼續原飼料喂養至22周，分別在1、8、16、22周測量血糖。實驗末，各組大鼠麻醉后，測量左室收縮壓、左室舒張末壓、左室腔內壓力變化率最大值（±dp/dtmax）。將3組大鼠處死后心臟制備成約4～5 mm的組織塊若干塊，按常規方法將組織塊進行處理。

1.3.1.2 心肌成纖維細胞增殖模型（CFb）的建立 取出生后1～3 d齡的大鼠，無菌開胸取心臟，D-Hank’s液清洗，剪成1 mm3大小的碎片，0.125%胰蛋白酶反復消化（37 ℃水浴，8 min/次），分別收集各次消化上清液，離心（1000 r/min，5 min）棄上清，用含10%血清的IMDM培養基重懸沉淀制成細胞懸液，接種于培養瓶中，置37 ℃、5% CO2培養箱內培養。用反復差速貼壁法去除內皮細胞及心肌細胞。實驗采用第3～5代細胞。分為兩組，化橘紅預處理組為血清培養基加0.5 mmol/L化橘紅藥液，而對照組為等量血清培養基。

1.3.2 心功能測定 實驗末將3組大鼠用3%戊巴比妥鈉按l mL/kg腹腔注射麻醉后，將心導管插入左心室，測量左室收縮壓、左室舒張末壓、左室腔內壓力變化率最大值，觀察化橘紅對糖尿病大鼠心功能的影響。

1.3.3 病理組織學檢查 將4%多聚甲醛固定后的大鼠心臟制備成約4～5 mm的組織塊，按常規方法將組織塊進行脫水，二甲苯透明，浸臘，包埋。將包埋的組織蠟塊分別連續切片，切片厚5 mm，于60 ℃恒溫箱中烤片6 h，用Masson染色后采用LEICA數字圖像分析系統計算每例切片心肌間質綠染面積占整個視野的百分比，在光鏡下觀察心肌組織形態學改變。

1.3.4 測定心肌膠原總量 稱取左心室心肌組織100 mg，制粉末后置于HCL液中酸解，用NaOH液滴定至pH為7，離心后取上清液加檸檬酸緩沖液、氯胺，混勻后氧化6 min，加過氯酸后混勻放置5 min，再加10%對二氨苯甲醛，于l80 ℃水浴中放置6 min，取出后冰水浴中放置30 min，UV-1206型分光光度計560 nm處比色測定。同時用1～10 μg的羥脯氨酸標準品按上述相同步驟制作標準曲線。對照標準曲線，求得羥氨酸含量，然后換算成每克心肌組織中羥脯氨酸含量，再乘以7.46即得心肌膠原總含量。

1.3.5 心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化

1.3.5.1 免疫組化觀察 NC組中Ⅰ型膠原呈索條狀，平行或波浪形排列，分布于間質。在小血管周圍呈不連續分布，Ⅲ型膠原呈細纖維狀或網狀排列，與Ⅰ型膠原分布相一致。DCM組中見Ⅰ、Ⅲ型膠原明顯增多，排列紊亂，以炎細胞浸潤的血管旁增多更為明顯。化橘紅組介于兩者之間，接近NC組。

1.3.5.2 Ⅰ、Ⅲ型膠原含量 提取心肌組織，運用免疫組化ABC法（親和素-生物素-過氧化物酶復合物法）檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原含量[6]。結果判定：組織中棕黃色為陽性結果，采用圖像分析軟件對染色陽性物質進行測定，測定灰度均值和陽性面積百分比，Ⅰ、Ⅲ型膠原表達以免疫組化陽性指數（灰度均值×陽性面積百分比）表示。

1.3.6 Western印跡檢測 提取心肌組織（細胞）總蛋白，以標準蛋白為內參照，以目的蛋白條帶灰度與內參條帶灰度的比值計算蛋白的相對表達量[7]。所有實驗均重復3次。測量TGF-β1、MMP-9、MMP-2、TIMP-1、Smad、c-fos等蛋白含量。

1.3.7 CFb的免疫組化分析、Western印跡檢測 取第3代CFb制成細胞懸液，給予細胞不同處理，用免疫熒光細胞化學染色法[4]檢測iNOS蛋白、Cyclin D蛋白的表達、檢測上清液中一氧化氮的變化、流式細胞儀（FCM ）檢測p27蛋白表達，Western印跡測量TGF-β1蛋白的含量，以標準蛋白為內參照，以目的蛋白條帶灰度與內參條帶灰度的比值計算蛋白的相對表達量[7]。

1.3.8 心肌組織 (細胞) 總RNA的提取和RT-PCR 取心肌組織約100 mg，放入勻漿器中，立即加入Trizol1 mL，在冰浴條件下用眼科剪將組織剪碎，用勻漿器將組織勻漿。棄上清，在冰浴中加入DEPC 20～30 μL, 輕彈管底，使DNA溶解，-70 ℃保存備用。合成cDNA，設計與合成相應引物，進行RT-PCR。測量相應蛋白mRNA表達情況。以標準mRNA為內參照，以目的mRNA條帶灰度與內參條帶灰度的比值計算蛋白的相對表達量[7]。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 化橘紅干預后對血糖和心功能的影響

造模后的1、8、16、22周，化橘紅組大鼠的血糖比DCM組顯著降低（P＜0.05）。實驗末，化橘紅組的左室收縮壓、左室腔內壓力變化率最大值明顯高于DCM組（P＜0.05）；化橘紅組的左室舒張末壓與DCM組相比不同程度下降（P＜0.05，表1）。

表1 化橘紅干預后對血糖和心功能的影響（）

表1 化橘紅干預后對血糖和心功能的影響（）

組別n 左室腔內壓力變化率最大值（±dp/dt max）1周8周16周22周血糖（mmol/L） 左室收縮壓（mmHg）左室舒張末壓（mmHg）化橘紅組145.53±0.596.61±1.078.83±1.2410.75±2.1613.82±3.186.28±2.044.29±1.39 DCM組118.72±1.3710.28±2.3614.47±4.1919.28±6.039.52±2.049.19±3.232.37±0.68 t-1.532-2.416-3.313-3.9122.621-2.1281.372 P 0.0410.0230.0190.0080.0170.0320.048

2.2 光鏡下心肌形態學改變

從心肌組織切片看，NC組大部分心肌纖維形態均勻，排列成束，肌束內見少量結締組織及豐富的毛細血管，未見炎癥細胞及纖維化。DCM組可見大部分心肌纖維腫脹、肥大、疏松，排列紊亂，有的可見肌纖維斷裂、肥大，排列紊亂，甚至空泡變，細胞核固縮、裂解，細胞外間質增加，局灶性纖維組織增生，炎細胞浸潤。化橘紅組心肌纖維排列整齊，但是仍可見少部分區域肌纖維腫脹，未見炎癥細胞浸潤。

2.3 3組大鼠心肌各型膠原含量與心肌纖維化情況

實驗末我們將3組大鼠的心肌組織標本處理后分別對其各型膠原含量、心肌羥脯氨酸含量、心肌膠原總含量、心肌間質纖維化%相比較。①與DCM組比較，化橘紅組Ⅰ型膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比值、心肌羥脯氨酸含量、心肌膠原總含量、心肌間質纖維化%均有不同程度的下降，且有統計學差異（P＜0.05）。②DCM組與NC組比較，Ⅰ型膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比值、心肌羥脯氨酸含量、心肌膠原總含量、心肌間質纖維化%均有顯著的上升，且有統計學差異（P＜0.05，表2）。

2.3 化橘紅干預對信號通路的影響

實驗末，化橘紅組的TGF-β1蛋白及mRNA、MMP-9、MMP-2、TIMP-1蛋白、c-fos蛋白及mRNA、Smad2蛋白和Smad7蛋白的表達與DCM組相比顯著下調（P＜0.05，表3）。

2.4 化橘紅對CFb增殖的影響

在實驗末CFb模型中，與對照組相比，化橘紅預處理組的TGF-β1蛋白、iNOS蛋白、一氧化氮、p27蛋白、p27蛋白、Cyclin D蛋白表達均有顯著地上調（P＜0.05，表4）。

3 討論

DCM主要的病理表現為心肌肥大，心室質量/體質量比（心臟質量指數）增加，局灶性心肌壞死，細胞外基質沉積，心肌纖維化[8]。DCM的發病機制較為復雜，與氧化應激和炎癥反應的異常[9]、腎素-血管緊張素系統（RAS）的激活[10]、葡萄糖代謝障礙、細胞內鈣超載[11]以及心肌間質纖維化[12]有關。在心肌組織的整個膠原網絡中，Ⅰ/Ⅲ型膠原起主要作用，I型膠原決定心肌的僵硬度，而Ⅲ型膠原則決定心肌的順應性[13]。本實驗結果與高俊杰等[14]研究相同，DCM組的大鼠與NC組相比較，其Ⅰ型膠原和Ⅰ/Ⅲ型膠原比值顯著增高，且心功能下降、心肌纖維化明顯。這反映了心肌細胞間質纖維沉積及纖維化是臨床上引起DCM的重要因素。柚皮苷是化橘紅中重要的活性物質，國內外研究顯示，柚皮苷可有效改善糖尿病時的糖代謝，降低血糖[4]，同時減少心肌損傷，保護心肌，改善心功能[15]。在本次實驗中，化橘紅組大鼠在各時間點的血糖，與DCM組相比，均明顯下降；其心收縮、舒張功能有不同程度的改善。綜合病理形態學結果也證實化橘紅確實能改善DCM大鼠的糖代謝，對大鼠心肌有確切的保護作用。

表2 3組大鼠心肌各型膠原含量與心肌纖維化情況（）

表2 3組大鼠心肌各型膠原含量與心肌纖維化情況（）

*P＜0.05 vs DCM組;#P＜0.05 vs NC組.

組別nⅠ型膠原含量(*103)Ⅰ/Ⅲ型膠原比值 心肌羥脯氨酸含量（μg/mg） 心肌膠原總含量（μg/mg） 心肌間質纖維化（%）化橘紅組14104.52±43.23*1.14±0.22*0.57±0.24*4.38±0.79*19.37±9.16*DCM組11126.27±53.71#1.52±0.31#0.87±0.39#6.93±1.75#37.26±16.03#NC組1583.63±32.160.84±0.220.36±0.173.52±0.252.21±0.35

表3 化橘紅干預對信號通路的影響（，%）

表3 化橘紅干預對信號通路的影響（，%）

組別nTGF-β1 mRNATGF-β1MMP-9MMP-2TIMP-1Smad2Smad7c-fosc-fos mRNA化橘紅組1446.38±22.7134.29±10.3725.38±8.1625.94±15.4823.73±7.0426.34±9.1921.47±7.1225.78±11.4834.79±16.38 DCM組1171.23±39.1963.12±21.47 49.29±17.3753.28±31.4745.81±15.1051.28±19.1643.19±18.3844.39±20.1953.28±23.29 t-8.192-6.729-5.3813.192-5.102-5.729-4.982-5.720-6.182 P 0.0000.0020.0080.0310.0130.0110.0190.0150.006

表4 化橘紅對CFb增殖的影響（，%）

表4 化橘紅對CFb增殖的影響（，%）

組別nTGF-β1iNOS一氧化氮p27Cyclin D對照組1431.28±16.2621.84±11.7412.28±6.813.14±1.0524.12±9.64化橘紅預處理組1149.19±23.8330.17±15.1220.16±8.185.92±2.13 37.29±16.12 t-5.917-3.117-2.921-1.883-4.039 P 0.0080.0210.0350.0420.009

研究表明，TGF-β1/Smad通路是DCM炎癥反應中的重要環節[16-17]。TGF-β1可以增加大鼠心肌成纖維細胞產生膠原和誘導其分化為心肌成纖維細胞能力，使膠原蛋白增加，加劇心肌纖維化[14]。而Smads作為TGF-β1受體胞內激活底物, 除可介導TGF-β1的信號轉導外，還可介導其下游致心肌纖維化和心肌肥厚的信號轉導[18]。本實驗發現化橘紅組的大鼠較DCM組，其TGF-β1蛋白與mRNA的表達明顯下調，Smad2、7蛋白的表達也明顯降低。在心肌成纖維細胞模型中，化橘紅預處理組的TGF-β1蛋白表達明顯低于對照組。表明化橘紅能有效通過抑制TGF-β1/Smad通路，抑制DCM大鼠的心肌纖維化進程。

心肌MMPs是基質降解的主要調節因子，其活性增強見于DCM中[19]，同時伴隨組織型基質金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1蛋白表達的上調，MMPs/TIMPs系統與膠原的降解有重要關系[20]。在本研究中，化橘紅組與DCM組相比，TGF-β1和MMPs蛋白的表達均有所下調，該結果與Siena[21]的研究類似。TGF-β作為MMPs/TIMPs系統重要的調控因子，本實驗顯示化橘紅通過對其表達的抑制，調控MMPs/TIMPs，改善心肌膠原的降解作用，從而改善心肌纖維化進程。本研究還發現，用化橘紅干預過的大鼠、心肌成纖維細胞，其氧化應激和炎癥反應的相關蛋白及mRNA表達也下降，如c-fos蛋白[22]、一氧化氮[23]、iNOS蛋白、p27蛋白[24]、Cyclin D蛋白[25]等。這些結果提示化橘紅調控DCM的心肌纖維化進程可能還與多種通路相關。

實驗結果提示化橘紅對DCM有明顯的積極作用，尤其能調控其心肌纖維化進程中的關鍵環節，對化橘紅進一步提純應用于DCM治療用藥有參考意義。同時，明確化橘紅對TGF-β1/Smad通路的調控作用能進一步完善其藥理機制，使其應用在更多疾病的治療中。因此，化橘紅對DCM中TGF-β1/Smad通路起到了抑制作用，從而調控其下游的MMPs/TIMPs等通路，改善DCM的心肌纖維化進程，抑制心肌肥厚，減少心肌的損傷。而化橘紅對于DCM心肌纖維化的抑制作用是否還存著其他重要通路，還需要進一步實驗探究。

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Effect of exocarpium on TGF-β1/Smad signal pathway in diabetic cardiomyopathy rat myocardial cells

YANG Cheng1, LIU Liwei21Department of Internal Medicine, Zhaoqing Medical College, Zhaoqing 526060, China;2the Second Clinical College, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China

ObjectiveTo observe the effect of exocarpium on TGF-β1/Smad signal pathway in diabetic cardiomyopathy (DCM)rat myocardial cells.Methods1) To construct the model of DCM rats, 40 rats were treated with streptozotocin, 15 rats with blood glucose ＜16.7 mmol/L were in blank control group. The remaining 25 rats with blood glucose ＞16.7 mmol/L were randomly divided into diabetic cardiomyopathy group (DCM group, n=11) and exocarpium group (n=14). Rats of exocarpium group were given exocarpium [400 mg/(kg·d)], DCM group and control group were given normal saline. Different time of blood glucose (1, 8, 16, 22 weeks) were measured.Heart function index measurement, myocardial morphological changes were observed under light microscope.Quantitative analysis of myocardial fibrosis was performed by electron microscopy.Myocardial collagen amount, myocardial collagen content was determined by immunohistochemistry. Western blot detection of myocardial protein of TGF-β1, Smad, MMP-9, MMP-2, TIMP-1 and RT-PCR detection of mRNA of TGF-β1, MMP-9, MMP-2,TIMP-1.2) To construct the myocardial fibroblast proliferation model.All were randomly divided into two groups, there is serum medium with 0.5 mmol L-1 exocarpium in exocarpium pretreatment group, while the control group with serum medium. To detect two groups of NO changes, TGF-β1 protein, c-fos protein, p27 protein, iNOS protein, the expression of Cyclin D protein.ResultsCompared with DCM group, each time point of blood glucose, myocardial fibrosis, myocardial collagen and the total collagen were significantly decreased and systolic, diastolic function improved significantly In exocarpium groups (P＜0.05). TGF-β1, Smad, MMP-9, MMP-2, TIMP-1 protein expression were significantly reduced in exocarpium groups (P＜0.05). Protein mRNA expression was significantly inhibited in exocarpium groups (P＜0.05). Compared with control group, NO, TGF-β1 protein, c-fos protein, p27 protein, iNOS protein, Cyclin D protein decreased significantly in pretreatment group (P＜0.05).ConclusionExocarpium on TGF-β1/Smad pathway in diabetic cardiomyopathy performs an effect of inhibitory. It regulates downstream MMPs/TIMPs pathway, improve myocardial fibrosis, inhibit myocardial hypertrophy and reduce myocardial injury.

exocarpium; diabetic cardiomyopathy; TGF- β1; smad

2017-03-14

肇慶醫學高等專科學校創新強校工程建設項目（20140412）

楊 澄，醫師，博士，E-mail： zqmcyc@126.com；