支氣管哮喘患者血清相關miRNAs的檢測及其意義

孫海霞+張洪欽+劉波泉

[摘要] 目的 探討支氣管哮喘患者血清中miRNAs表達譜改變情況，從中發(fā)現(xiàn)與支氣管哮喘相關的miRNAs。 方法 選擇2014年8月～2015年10月在解放軍四二一醫(yī)院確診的48例哮喘急性發(fā)作期患者為哮喘組，另選擇同期醫(yī)院體檢科健康體檢者40例為對照組。通過miRNA表達譜芯片技術，對兩組血清中差異表達的miRNAs進行檢測，篩選得到的miRNAs通過實時熒光定量RT-PCR驗證。 結果 哮喘組患者血清miR-155、miR-150和miR-145的表達明顯高于對照組（P < 0.05）；而miR-34b-5p的表達則明顯低于對照組（P < 0.05）。 結論 支氣管哮喘患者血清中miRNAs表達譜發(fā)生明顯變化，提示血清miRNAs可能作為是支氣管哮喘的檢測指標，也可能作為未來哮喘治療的新靶點。

[關鍵詞] miRNA芯片；支氣管哮喘；血清

[中圖分類號] R562.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0058-03

Detection and clinical significance of miRNAs in serum of patients with bronchial asthmaandits

SUN Haixia1 ZHANG Hongqin1 LIU Boquan2

1.Department of Geriatrics， Hospital No.421 of PLA， Guangdong Province， Guangzhou 530318， China； 2.Physical Examination Center， Guangdong Second People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 530318， China

[Abstract] Objective To investigate changes of expression profile of miRNAs in serum of patients with bronchial asthma， in order to discover the miRNAs related to bronchial asthma. Methods From August 2014 to October 2015， in Hospital No.421 of PLA， 48 patients diagnosed with acute asthma were selected as asthma group， 40 healthy persons had physical examination at the same period were selected as control group. Expression of miRNAs in serum of patients with bronchial asthma and healthy controls were detedted by miRNA microarray technique， and miRNAs obtained by screening were validated by real time fluorescent quantitative RT-PCR. Results The expression of miR-155， miR-150 and miR-14 in serum of asthma group were higher than control group （P < 0.05）； and the expression of miR-34b-5p was lower than control group （P < 0.05）. Conclusion The expressing profile of miRNAs in serum of patients with bronchial asthma changed significantly， indicating that serum miRNAs can be used as detecting parameter for bronchial asthma and may also serve as new targets in the treatment of asthma in the future.

[Key words] miRNA microarray； Bronchial asthma； Serum

支氣管哮喘（簡稱“哮喘”）是指由多種細胞特別是肥大細胞、嗜酸粒細胞和T淋巴細胞參與而引起的慢性氣道炎癥。近年來哮喘患病率在全球呈逐年上升的趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球有約1.6億哮喘患者，我國的哮喘患病率為1%～4%。哮喘的發(fā)病機制十分復雜，目前普遍認為由于各種致病因素導致的細胞因子的網(wǎng)絡失衡是哮喘發(fā)病最主要的致病機制[2]。非編碼小分子RNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈小分子RNA，長度20～25 nt，多存在與動植物體真核細胞內(nèi)，能夠特異性地降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯[3]。已有研究表明，miRNA廣泛參與調(diào)控各種生理病理的生物學進程[4-5]。此外，疾病患者血清中miRNA表達譜和表達水平的改變也能反映許多疾病的病理過程[6]。通過miRNA芯片技術對哮喘患者血清中miRNAs表達譜情況的檢測，為miRNA在哮喘發(fā)病中的分子機制及潛在的應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年8月～2015年10月解放軍第四二一醫(yī)院確診的48例哮喘急性發(fā)作期患者的血清樣本作為哮喘組。所有患者均符合中華醫(yī)學會2008年制訂的診斷標準[7]。其中男17例，女31例，平均年齡（37.6±12.8）歲。所有哮喘患者在研究期間無肺炎、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺間質(zhì)性疾病、自身免疫性疾病及其他系統(tǒng)炎癥疾病，均無吸煙史或者戒煙至少2年，F(xiàn)EV1占預計值百分數(shù)為（75±21）%，且皮膚過敏原點刺試驗均為陽性。另選擇同期醫(yī)院體檢科健康體檢者40例為對照組，其中男13例，女27例，平均年齡（38.2±10.5）歲。兩組資料在性別、年齡等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。所有血清樣本在采集前均向受試者說明研究目的并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

MiScript Reverse Transcription Kit（Qiagen公司，德國）；MirVanaTM miRNA Isolation Kit（Ambion公司，美國）；miRNA芯片（v 1.0）（Exiqon公司，丹麥）；miR-155、miR-150、miR-145、miR-34b-5p及U6引物序列購于天根生化科技（北京）技術有限公司；ABIprism 7900HT PCR儀（Applied Biosystems公司， 美國）。

1.3 血清標本采集

所有患者于清晨空腹采集5 mL外周靜脈血，室溫靜置1 h后3000 r/min，離心15 min，離心半徑1 cm，取上清并于-80°C冰箱保存待測。

1.4 miRNA表達譜芯片檢測

①采用試劑盒提取總RNA和miRNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度及完整性。②探針制備：miRCURYR Array Power 標記試劑盒標記Hy3TM：熒光基團，制備miRNA熒光標記探針。③miRNA芯片雜交：探針和miRCURYR芯片雜交在PhalanxTM熱收縮雜交袋內(nèi)進行，芯片實驗數(shù)據(jù)納入MeV 4.0軟件進行聚類分析。

1.5 RT-PCR驗證

對miR-155、miR-150、miR-145和miR-34b-5p的基因芯片結果進行驗證。Trizol法抽提樣品總RNA，stem-loop進行miRNA逆轉錄。反應條件如下：16°C，30 min；42 °C，40 min；85 °C，5 min。RT-PCR反應按以下程序進行擴增：95°C，10 min；40個PCR循環(huán)（95°C，15 s；60°C，30 s；72°C，30 s），擴增反應結束后以每5秒升高1°C的速度繼續(xù)緩慢加熱到99°C，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，U6 snRNA為內(nèi)參，2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行分析（CT值：每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定閾值時的循環(huán)數(shù)）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

兩組實驗對象血清中miR-155、miR-150、miR-145和miR-34b-5p的表達水平存在顯著差異，見表1。結果顯示：哮喘組患者血清miR-155、miR-150和miR-145的表達上較對照組明顯上調(diào)（P < 0.05）；而 miR-34b-5p的表達則明顯下調(diào)（P < 0.05）。

3 討論

哮喘的發(fā)病機制相當復雜，目前還不完全清楚，主要包括：變態(tài)反應、氣道高反應性、氣道慢性炎癥、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)失常、遺傳機制、神經(jīng)信號轉導機制和氣道重構及其相互作用等。目前哮喘的診斷主要靠臨床表現(xiàn)和肺功能檢測，缺乏預見性和前瞻性。哮喘的治療主要通過吸入激素和其他藥物（如β2-受體激動劑）的抗炎和解除支氣管痙攣，從而緩解哮喘癥狀。然而這些藥物需長期使用且具有一定的副作用[8]。因此，如何深入研究哮喘的發(fā)病機制，進而尋找更有效的治療手段，是目前研究的熱點。

對miRNA結構與功能的深入研究表明，miRNA參與真核細胞內(nèi)多種生物學的調(diào)節(jié)途徑。在人體腫瘤發(fā)病機制、生理病理過程起重要作用，這對于人類腫瘤發(fā)病機制和診治提出新的思路[9-11]。近年來，miRNA在哮喘發(fā)病過程中的作用日益受到重視。Dragon等[12]使用miRNA芯片對比檢測健康者及輕度哮喘患者肺組織miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-92、miR-26a、miR-200c、let-7b、mi-16、miR-125a和miR-125b在哮喘患者肺組織中為高表達，提示這些miRNAs可能是調(diào)控氣道及肺組織相關基因表達的miRNA。有研究表明，miRNA-155在T細胞向Thl細胞和Th2細胞的分化過程中起了關鍵作用。且miR-155可以通過下調(diào)白介素-13al受體的表達以調(diào)控IL-13通路，因此推測miR-155可能通過其明顯的抗炎作用調(diào)控哮喘的發(fā)病過程[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA在血清中的表達水平穩(wěn)定，但在人體處于疾病狀態(tài)下時其表達水平出現(xiàn)異常[15-16]。因此，miRNA及其調(diào)控的基因的表達差異可作為疾病的檢測指標[17]，也有助于疾病的治療[18-19]。本研究采用基于LNATM技術的捕獲探針對支氣管哮喘患者血清中miRNAs表達譜改變情況進行檢測分析。數(shù)據(jù)結果顯示：兩組實驗對象血清中miR-155、miR-150、miR-145和miR-34b-5p的表達水平存在統(tǒng)計學差異（P < 0.05），哮喘組患者血清miR-155、miR-150和miR-145的表達上較對照組明顯上調(diào)（P < 0.05）；而miR-34b-5p的表達則明顯下調(diào)（P < 0.05），提示血清miRNA不僅可以作為哮喘患者的血清學檢測指標，也可能參與哮喘發(fā)病過程的調(diào)控，甚至可能作為未來哮喘治療的新靶點[20-21]。

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（收稿日期：2016-12-14 本文編輯：蘇 暢）