過表達BCL-2對急性腦梗死大鼠神經細胞凋亡及相關基因的影響

彭靜華，張育德，張鴻日，閆俊強

過表達BCL-2對急性腦梗死大鼠神經細胞凋亡及相關基因的影響

彭靜華，張育德，張鴻日，閆俊強

目的 探討采用慢病毒介導BCL-2在急性腦梗死大鼠腦組織過表達對神經細胞凋亡及凋亡基因的影響。方法 45只大鼠隨機分為假手術組、模型組和觀察組。假手術組大鼠只分離血管不插入線栓，后兩組采用線栓法建立大鼠大腦中動脈腦梗死模型。假手術組和模型組分別于手術前10 d通過顱內動脈給予慢病毒空載體，觀察組給予慢病毒BCL-2過表達載體。在線栓法制作大鼠大腦中動脈腦梗死模型72 h后，分析大鼠腦組織中凋亡相關基因(caspase-3,Bax)的表達以及腦細胞凋亡情況。結果 慢病毒介導的BCL-2表達質粒可在大鼠腦組織中表達。觀察組大鼠腦組織中BCL-2的水平明顯高于假手術組和模型組。與假手術組相比，模型組、觀察組大鼠腦組織caspase-3和Bax蛋白表達水平明顯升高(均P<0.05)，觀察組大鼠腦組織中caspase-3和Bax蛋白的表達水平較模型組明顯降低(均P<0.05)，但仍顯著高于假手術組(均P<0.05)。與假手術組比較，模型組和觀察組腦組織神經細胞凋亡明顯增加(均P<0.05)。結論 過表達BCL-2可降低大鼠腦組織神經細胞caspase-3和Bax蛋白的表達，降低凋亡水平，對神經具有一定保護作用。

腦梗死；BCL-2；細胞凋亡；caspase-3；Bax；大鼠

急性腦梗死具有高發病率、高死亡率、高致殘率的特點，已經成為嚴重威脅人類健康的疾病類型之一[1]。急性腦梗死腦組織血液供應發生障礙，導致局部腦組織因缺血發生壞死、軟化，在缺血中心不可逆壞死區域與正常腦組織之間存著缺血半暗帶區，該區域的組織在功能上呈現可逆性損害，這部分神經細胞仍呈現正常的組織結構，但是在形態學上表現為凋亡狀態[2]。而細胞的凋亡則是由基因調控細胞程序性死亡的過程，其中BCL-2是一個重要的與細胞凋亡相關的蛋白，其由239個氨基酸組成，在抑制細胞凋亡的過程中發揮著重要作用[3]。目前研究顯示BCL-2基因和蛋白在急性腦梗死腦組織中表達下調，導致BCL-2家族成員Bax形成同源二聚體，使腦梗死細胞凋亡水平明顯增加，加劇了腦梗死神經功能的損傷程度[4]。通過抑制腦梗死半暗帶細胞的凋亡，則可達到保護神經功能的作用。本研究采用慢病毒介導BCL-2載體，探討BCL-2在急性腦梗死大鼠腦組織特異性高表達，對大鼠腦神經細胞凋亡及凋亡相關基因的影響，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 實驗儀器和材料 SD大鼠(體質量180～200 g)購自上海斯萊克動物中心，HRP-羊抗鼠二抗購自北京中杉有限公司，Triozol購自Invitrogen公司，BCL-2、caspase-3和Bax鼠單克隆抗體購自美國Santa公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物有限公司。

1.2 急性腦梗死大鼠模型構建 采用LONGA的方法[5]建立大鼠大腦中動脈腦梗死模型。在手術后2 h內大鼠表現出精神萎靡、同側霍納氏癥、對側前肢下垂、內收內旋并自發性向患側轉圈說明建模成功。若無此表現說明構建模型失敗，則剔除該大鼠。實驗分為3組：假手術組、模型組和觀察組，每組15只。假手術組大鼠只分離血管不插線栓，假手術組和模型組分別于手術前10 d通過顱內動脈給予慢病毒空載體(GC-FU-BCL-2)，觀察組給予慢病毒BCL-2過表達載體(GC-FU-EGFP)。

1.3 caspase-3和Bax蛋白的變化 大鼠建模72 h立即取出腦組織，置于液氮中，采用研缽將組織研碎，然后置于1×loading buffer中在100 ℃金屬浴中煮沸10 min，樣品12 000 r·min-1離心5 min，然后進行SDS-PAGE并將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉，然后用caspase-3和Bax一抗包被過夜，PBST洗滌3次，然后用HRP偶聯的羊抗鼠二抗室溫包被1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，然后加發光液，顯色，拍照。同時以β-actin作為內參，采用灰度計算軟件分析目的蛋白條帶灰度，計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 TUNEL分析腦組織細胞凋亡水平 大鼠建模72 h后處死大鼠，腦組織采用OCT包埋，然后采用冰凍切片機將腦組織切成厚度為7 μm的切片，黏附于玻片上。然后按照TUNEL試劑盒說明書進行操作。大體操作流程如下：玻片采用4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)固定，用2 mg·mL-1的Proteinase K溶液處理玻片，然后滴加100 μL1×Equilibration Buffer于標本區域，孵育30 min后棄液體，在玻片上滴加50 μL TdT孵育緩沖液。37 ℃孵育60 min。PBS洗滌3次，每次5 min，用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。立即在熒光顯微鏡下分析樣本。觀察時標本放大400倍，隨機選取梗死區周邊的區域10個視野，計算凋亡細胞占總細胞的比例作為腦細胞的凋亡指數。

2 結果

2.1 BCL-2表達水平比較 與假手術組和模型組比較，觀察組大鼠經慢病毒介導的BCL-2載體在腦組織中表達高水平的BCL-2蛋白。對3組大鼠腦組織中BCL-2蛋白的水平分析顯示：觀察組(0.936±0.218)大鼠腦組織中BCL-2的表達水平明顯高于假手術組(0.390±0.118)和模型組(0.345±0.191)(P<0.05)，見圖1。

①與模組比較，P<0.05；②與假手術組比較，P<0.05。A：3組大鼠腦組織BCL-2表達B：3組大鼠腦組織BCL-2表達定量分析圖1 3組大鼠腦組織中BCL-2蛋白的表達水平變化

2.1 不同處理組大鼠腦組織中caspase-3和Bax水平比較 與假手術組(0.225±0.179)比較，模型組(1.211±0.338)和觀察組(0.585±0.216)大鼠腦組織中caspase-3的表達水平顯著升高(P<0.05)。與假手術組(0.303±0.207)比較，模型組(1.500±0.408)和觀察組(0.782±0.310)大鼠腦組織中Bax蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。而在慢病毒介導的BCL-2高表達的大鼠中，其腦組織中caspase-3和Bax蛋白的表達水平較模型組明顯下降(P<0.05)，見圖2。

①與假手術組比較，P<0.05。A：3組大鼠腦組織caspase-3和Bax蛋白表達情況B：3組大鼠腦組織Caspase-3和Bax蛋白表達定量分析圖2 3組大鼠腦組織中Caspase-3和Bax蛋白的表達水平變化

2.2 3組大鼠腦組織神經細胞凋亡比較 大鼠建模后72 h腦組織細胞凋亡指數和梗死范圍明顯增加，而在過表達BCL-2的大鼠腦組織中細胞凋亡指數降低，(如圖3A所示)。對凋亡水平進行定量分析顯示，與假手術組(2.95±1.93)比較，模型組(41.05±3.58)大鼠腦組織中細胞凋亡指數顯著增加(P<0.05)。而觀察組(12.84±2.32)大鼠腦組織中細胞凋亡指數較模型組(41.05±3.58)則顯著性下降(P<0.05)，但是其水平仍然顯著高于假手術(2.95±1.93)組(P<0.05)(如圖3B)。

①與假手術組比較，P<0.05。A：3組大鼠腦細胞凋亡情況 (TUNEL熒光染色 x400)B：3組大鼠腦細胞凋亡指數變化圖3 3組大鼠腦組織細胞凋亡指數情況比較

3 討論

細胞凋亡是指細胞在一定生理或者病理條件下，由許多基因精密調控的程序化死亡過程，是細胞維持自我穩定的重要機制[6]。目前研究發現急性腦梗死過程中半暗帶區域細胞凋亡是治療急性腦梗死的關鍵，這部分細胞具有可逆性，可通過抑制細胞凋亡使其恢復功能。因此有效抑制該區域細胞的凋亡對降低腦組織細胞凋亡，降低神經功能損傷具有重要的意義[7]。BCL-2是細胞凋亡調控中主要的調控蛋白，是主要的凋亡抑制蛋白。研究發現急性腦梗死BCL-2的表達水平明顯下降，說明機體抗凋亡能力下降，細胞凋亡的穩態被打破[8]。因此通過重建腦組織中凋亡穩態環境，可能抑制腦梗死半暗帶區域細胞的凋亡，對腦組織起到保護作用。

本研究采用慢病毒介導BCL-2在大鼠腦組織中過表達BCL-2，Western bolt顯示觀察組大鼠腦組織中BCL-2的表達水平明顯增加，說明采用慢病毒作為傳輸載體可實現BCL-2在腦組織中的過表達。本研究進一步論證了過表達BCL-2對大鼠其他凋亡相關基因表達的影響。caspase-3是caspase級聯反應下游最關鍵的凋亡直接介導者，其激活依賴于cyt-c的釋放，而BCL-2家族包括BCL-2可通過線粒體途徑介導cyt-c等物質的釋放[9-10]。目前研究證實急性腦梗死大鼠和患者腦組織或外周血中caspase-3和Bax水平明顯升高[11-12]。BCL-2可抑制細胞凋亡的發生，本研究發現BCL-2高表達后大鼠腦組織中caspase-3和Bax蛋白水平較模型組顯著下降，說明BCL-2高表達具有抑制大鼠腦組織細胞凋亡的作用。這一現象通過TUNEL染色得到了進一步的確認。

綜上所述，急性腦梗死大鼠腦組織高表達BCL-2可顯著減少凋亡相關基因caspase-3和Bax的表達，抑制腦細胞凋亡，為急性腦梗死治療藥物研發提供了一定的理論基礎。

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Effects of BCL-2 Overexpression on Neuronal Apoptosis and Related Genes in Rats with Acute Cerebral Infarction

PENG Jing-hua, ZHANG Yu-de, ZHANG Hong-ri, YAN Jun-qiang

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo investigate the effects of BCL-2 overexpression mediated bylentivirus on neuronal apoptosis and related genes in rats with acute cerebral infarction.Methods45 rats were randomly divided into sham group (only isolated vascular suture unplugged), model group and observation group. At 10 days before operation, rats in sham group and model group were treated with empty vector mediated by lentiviral;rats in observation group were treated with BCL-2 overexpression mediated by lentivirus null carrier. After middle cerebral artery infarction model were constructed at 72 h， the caspase-3, BCL-2, Bax protein apoptosis index of rat brain were analyzed.ResultsBCL-2 protein mediated by lentivirus could be expressed in rat brain. BCL-2 protein levels in observation group was significantly higher than that of sham group and model group(allP<0.05). Caspase-3 and Bax protein levels in model group was significantly higher than that of sham group(allP<0.05), while caspase-3 and Bax protein levels in observation group were significantly lower than that of model group(allP<0.05) , but it were significantly higher than that of sham group(allP<0.05). Apoptosis in model group and observation group was significantly higher than that of sham group (allP<0.05).ConclusionOverexpression of BCL-2 could reduce the level of apoptosis in rat of acute cerebral infarction and have a protective effect on brain.

cerebral infarction；BCL-2；apoptosis；caspase-3；Bax；rat

1672-688X(2017)02-0085-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.002

1.國家自然科學基金(U1304809) 2.河南洛陽市青年醫學科技創新聯合專項資金項目(1503008A-15)

2017-04-12

河南科技大學第一附屬醫院，河南洛陽 471003

彭靜華(1980—)，女，河南洛陽人，主治醫師，從事神經內科臨床工作。

張鴻日，男，副主任醫師，E-mail：hongrizhang@126.com

R743.33

A