二氫睪酮聯(lián)合ADSC對大鼠脊髓損傷BDNF及其受體TrkB的影響

王 瑩 李文媛(通訊作者) 尹國華 李智剛 金在順 滕誠毅 孫 平

1)牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室 牡丹江 157011 2)牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 牡丹江 157011 3)牡丹江醫(yī)學(xué)院病理教研室 牡丹江 157011

二氫睪酮聯(lián)合ADSC對大鼠脊髓損傷BDNF及其受體TrkB的影響

王 瑩1)李文媛1)(通訊作者) 尹國華2)李智剛1)金在順3)滕誠毅1)孫 平1)

1)牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室 牡丹江 157011 2)牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 牡丹江 157011 3)牡丹江醫(yī)學(xué)院病理教研室 牡丹江 157011

目的 探討二氫睪酮(DHT)與脂肪源性干細(xì)胞(ADSC)聯(lián)合應(yīng)用對大鼠脊髓損傷后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶B(TrkB)的表達(dá)和功能恢復(fù)的影響。方法 30只成年SD大鼠制備脊髓挫傷模型，隨機(jī)分為對照組、ADSC組和DHT+ADSC組。BBB行為學(xué)和電生理方法檢測運(yùn)動功能的恢復(fù)，Western bolt檢測脊髓損傷灶BDNF及其受體TrkB的蛋白表達(dá)。HE染色觀察脊髓損傷灶面積，免疫熒光示蹤PKH26標(biāo)記的移植ADSC。結(jié)果 與ADSC組比較，DHT+ADSC組脊髓損傷灶內(nèi)BDNF和TrkB蛋白相對表達(dá)明顯增高，PKH-26標(biāo)記的ADSC數(shù)量顯著增高(P<0.05)。與對照組比較，ADSC組和DHT+ADSC組電生理波幅增高、神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快、延遲期縮短，其中DHT+ADSC組神經(jīng)功能恢復(fù)作用顯著優(yōu)于ADSC組(P<0.05)，且DHT+ADSC組BBB指數(shù)高于對照組和ADSC組。結(jié)論 二氫睪酮聯(lián)合ADSC移植對大鼠脊髓損傷后改善損傷灶和功能恢復(fù)的作用優(yōu)于ADSC組，其機(jī)制可能與二氫睪酮促進(jìn)損傷灶BDNF及其受體TrkB表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)移植的ADSC存活有關(guān)。

二氫睪酮；脂肪源性干細(xì)胞；脊髓損傷；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；酪氨酸激酶B

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是由于各種因素引起脊髓病變導(dǎo)致機(jī)體感覺、運(yùn)動、肌力異常等一系列病理變化過程。脊髓損傷影響全球數(shù)百萬人，常對患者造成巨大的傷害[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，性腺類固醇激素睪酮為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后許多病理生理改變提供廣泛的神經(jīng)保護(hù)和治療作用[2]。睪酮可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)和防止神經(jīng)元細(xì)胞死亡，降低炎癥和自由基表達(dá)，并能夠加速失神經(jīng)軸突再生和功能恢復(fù)[3]。研究表明，睪酮還能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor，BDNF)等表達(dá)[4]，但其在脊髓損傷的作用及其機(jī)制報道較少。

我們前期研究[5]已證實，脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cell，ADSC)作為種子細(xì)胞能夠有效促進(jìn)脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)，但單獨(dú)使用ADSC運(yùn)動功能恢復(fù)效果并不理想。本研究擬將ADSC聯(lián)合在體內(nèi)具有較強(qiáng)睪酮活性的雄激素二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)治療，探討二氫睪酮聯(lián)合ADSC對脊髓損傷后BDNF信號通路和功能恢復(fù)的影響，為脊髓損傷提供新的治療方法。

1 材料和方法

1．1 細(xì)胞培養(yǎng) 參照前期研究方法取小鼠腹部脂肪組織進(jìn)行ADSC細(xì)胞分離、培養(yǎng)及傳代[4]，2周后茜草素紅染色鑒定ADSC向成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞鑒定后取第4代ADSC行PKH26(Sigma公司，美國)染色標(biāo)記[6]，進(jìn)行體內(nèi)移植實驗。

1．2 動物模型制備 30只成年Sprague Dawley(S-D)大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號：SCXK(黑)203-001]。手術(shù)前給予大鼠充分食物和水。用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒、鋪無菌單，以肋骨為定位中心，大鼠背部棘突體表作一長約3 cm手術(shù)切口，切開皮膚、皮下組織，剝離椎旁肌肉，止血，顯露棘突、椎板及關(guān)節(jié)突。用咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11椎板，顯露脊髓。在顯微鏡下可見一正中靜脈，用顯微外科剪垂直剪短右側(cè)脊髓，術(shù)中見大鼠雙下肢出現(xiàn)抽動，癱瘓，鏡下可脊髓右半部分完全橫斷，表現(xiàn)造模成功[2]。

1．3 動物分組 30只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為：(1)對照組(n=10)：脊髓半離斷損傷，注入100 μL PBS于損傷灶；(2)ADSC組(n=10)：注入等劑量ADSC(1×106個/100 μL)于脊髓損傷灶；(3)DHT+ADSC組(n=10)：同ADSC組方法進(jìn)行后，皮下給予DHT 0.2 mL(含有DHT 0.8 mg密度為4.0 mg/mL的醫(yī)用玉米油溶液，Sigma公司，美國)注射[7]，1次/d，給藥1周。3組術(shù)后28 d麻醉取材。

1．4 HE染色 冰凍切片在空氣中干燥1～2 d，用蒸餾水浸泡1～2 min；蘇木素溶液中浸泡1 min，蒸餾水洗凈。用1%鹽酸處理30 s，蒸餾水沖洗3 min，80%酒精脫水1～2 min，在伊紅染色1～2 min，蒸餾水洗凈，80%乙醇1 min、95%乙醇1 min、無水乙醇1 min、二甲苯 1 min，二甲苯1 min、二甲苯1 min，擦干后中性樹膠的封片。顯微鏡下觀察。

1．5 Western Bolt 檢測 Western Bolt檢測采用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；封閉緩沖液封閉后，加入兔抗BDNF抗體(1：200，Sigma公司，美國)和兔抗TrkB抗體(1：200，Sigma公司，美國)，4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠的二抗(1：2 000)孵育 2 h，TBS洗凈后經(jīng)顯色液顯示15 min，掃描后經(jīng) Image J 圖像分析軟件對印跡區(qū)進(jìn)行灰度分析。

1．6 BBB檢測 術(shù)后在不同時間點進(jìn)行行為學(xué)評分，根據(jù)BBB評分系統(tǒng)[7]觀察后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)情況，為確保評分的準(zhǔn)確性，均由2個人對大鼠2個后肢進(jìn)行了評價，取平均分，評分時間均在每天20：00。

1．7 電生理檢測 采用經(jīng)顱磁刺激MEP方法進(jìn)行電生理檢測[4]，應(yīng)用誘發(fā)電位儀和磁刺激器(Magstim 公司，英國)經(jīng)顱磁刺激運(yùn)動誘發(fā)電位觀察神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期、傳導(dǎo)速度及波幅改變，將電磁線圈置于顱骨激活皮層下組織誘發(fā)電生理反應(yīng)，每只鼠檢測4次取平均值。

2 結(jié)果

2．1 ADSC培養(yǎng)與分化 原代培養(yǎng)ADSC 8 d后形成的細(xì)胞群落較為密集，ADSC呈多角形或梭形伸展，有鋪路石狀特征。ADSC分化誘導(dǎo)成骨28 d后，可見分化細(xì)胞內(nèi)的鈣沉積茜素紅染色(圖1)。

圖1 A：原代培養(yǎng)ADSC 8 d后呈鋪路石狀 B：ADSC分化誘導(dǎo)成骨，細(xì)胞內(nèi)的鈣沉積茜素紅染色

2．2 HE染色結(jié)果 HE染色可見脊髓T10節(jié)段損傷灶，與對照組比較，DHT+ADSC組和ADSC組脊髓損傷灶面積比顯著降低，其中DHT+ADSC組損傷灶面積比低于ADSC組(F2，12=43.79，P<0.001)。見圖2。

圖2 各組脊髓T10損傷灶HE染色 AAV2-KLF7組與AAV2組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=5，標(biāo)尺：500 μm

2．3 Western Bolt結(jié)果 DHT+ADSC組和ADSC組脊髓損傷灶中BDNF及其受體TrkB蛋白表達(dá)較對照組顯著增高，其中聯(lián)合組BDNF及其受體TrkB蛋白表達(dá)高于ADSC對照組(BDNF：F2，12=49.28，P<0.001；TrkB：F2，12=61.43，P<0.001)。見圖3。

圖3 Western Bolt實驗檢測各組脊髓損傷灶中BDNF和TrkB 蛋白相對表達(dá)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=5

2．4 免疫熒光染色觀察 熒光顯微鏡下可見DHT+ADSC組和ADSC組在脊髓損傷灶有PKH26標(biāo)記的ADSC，DHT+ADSC組PKH26陽性表達(dá)顯著高于ADSC組(t=7.24，df=10，P<0.01。見圖4。

圖4 術(shù)后4周ADSC組和KLF7+ADSC組損傷灶PKH26免疫熒光觀察(A)、PKH26光密度值(B)，**P<0.01，n=5，標(biāo)尺：100 μm

2．5 BBB檢測 術(shù)后28 d，與對照組比較，DHT+ADSC組和ADSC組BBB指數(shù)顯著增高(F2，27=29.37，P<0.001)，而DHT+ADSC組與ADSC組差異并不顯著(P>0.05)。見圖5。

圖5 BBB評分 *P<0.05，n=5

2．6 神經(jīng)電生理檢測 與對照組比較，ADSC組和DHT+ADSC組神經(jīng)傳導(dǎo)速度及波幅顯著增加，而延遲期縮短，其中聯(lián)合組改善神經(jīng)電生理參數(shù)優(yōu)于ADSC組(神經(jīng)傳導(dǎo)速度：F2，15=65.22，P<0.05；延遲期：F2，15=14.32，P<0.05；波幅：F2，15=19.65，P<0.05。見表1。

表1 各組神經(jīng)電生理參數(shù)檢測±s，n=5)

注：與對照組比較，*P<0.05；與ADSC組比較，#P<0.05

3 討論

脊髓損傷除了會導(dǎo)致機(jī)體感覺和隨意運(yùn)動的障礙和影響自主神經(jīng)系統(tǒng)，同時導(dǎo)致多個器官功能障礙或衰竭，常對患者造成巨大傷害。為此，脊髓損傷成為全世界的研究熱點，其機(jī)制仍然不是很明確[1-2]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)[5，8]，種子細(xì)胞ADSC可合成和分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等，這些促進(jìn)神經(jīng)生長的因子表達(dá)變化提供軸突生長的營養(yǎng)。本研究電生理檢測結(jié)果也再次證實ADSC能夠促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)，但BBB指數(shù)結(jié)果表明ADSC組神經(jīng)功能恢復(fù)效果并不盡如人意，盡管其BBB指數(shù)有增高趨勢，大量研究證實[5-9]，聯(lián)合治療能夠克服多種抑制神經(jīng)軸突再生的因素，較單一治療效果更為明顯。

研究證實睪酮具有神經(jīng)保護(hù)作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，睪酮能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活，防止皮質(zhì)錐體細(xì)胞損傷誘導(dǎo)的樹突萎縮[2]，促進(jìn)腦卒中后早期功能恢復(fù)，并刺激周圍神經(jīng)損傷后運(yùn)動神經(jīng)元軸突的生長[10]。而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，睪酮能夠加速面神經(jīng)、舌下神經(jīng)、坐骨神經(jīng)軸突再生和神經(jīng)切斷后功能恢復(fù)[11-12]，但其促進(jìn)軸突再生的機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果證實，術(shù)后4周與ADSC組比較，聯(lián)合組BDNF及其受體TrkB蛋白在脊髓損傷灶內(nèi)表達(dá)顯著增高，證實二氫睪酮治療能夠有效激活BDNF細(xì)胞信號，與以往研究結(jié)果一致[3]，其機(jī)制可能是BDNF的表達(dá)是通過鈣依賴的信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，而cAMP反應(yīng)元件(CRE)和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)參與其信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。睪酮已證實能夠有效激活CRE和CREB，因此，睪酮介導(dǎo)cAMP信號通路能夠調(diào)控和促進(jìn)BDNF產(chǎn)生[11]。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組損傷灶PKH26標(biāo)記陽性細(xì)胞個數(shù)顯著高于ADSC組，且損傷灶面積比也顯著低于于ADSC組，因此，我們推測二氫睪酮可能通過激活BDNF細(xì)胞信號，促進(jìn)移植的ADSC增殖和存活，進(jìn)而改善脊髓損傷灶。研究還發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ADSC組和DHT+ADSC組顯著改善電生理參數(shù)，說明ADSC組和聯(lián)合組均能夠促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)，但二氫睪酮聯(lián)合ADSC治療效果明顯優(yōu)于ADSC組，其BBB指數(shù)也高于對照組和ADSC組，證實二氫睪酮聯(lián)合ADSC能夠協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，本研究探討聯(lián)合應(yīng)用二氫睪酮和ADSC治療脊髓損傷，證實聯(lián)合治療能夠改善大鼠脊髓損傷灶和功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與二氫睪酮激活BDNF信號通路，促進(jìn)移植的ADSC的存活有關(guān)。

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(收稿2016-11-06)

Effects of DHT combined with ADSC transplantation on expression of BDNF and its receptor TrkB after spinal cord injury in rats

WangYing*，LiWenyuan，YinGuohua，LiZhigang，JinZaishun，TengChengyi，SunPing

*DepartmentofAnatomy，MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China

Objective To study the effects of dihydrotestosterone(DHT)and adipose-derived stem cell(ADSC)transplantation on expression and functional recovery of brain-derived neurotrophic factors(BDNF)and receptor TrkB after spinal cord injury in rats．Methods A total of 30 healthy SD rats were randomly divided into control group，ADSC group and DHT+ADSC group．BBB and electrophysiology were used to evaluate functional recovery．BDNF and TrkB protein were evaluated by Western blotting．Lesion area was observed by HE staining and the fluorescence signal of transplanted ADSCs which were labeled with PKH-26 was tracked by using immunofluorescence．Results Compared with ADSC group，the expressions of BDNF，TrkB and ADSC in DHT+ADSC group were markedly increased(P<0.05)．Compared with control group，ADSC group and DHT+ADSC group showed faster nerve conduction velocity，higher wave amplitude and shorter incubation period(P<0.05)．Additionallly，the DHT+ADSC group made more progress in terms of neural functional recovery and higher BBB index than ADSC group and control group(allP<0.05)．Conclusion DHT combined with ADSC transplantation which can improve injury and functional recovery may show superiority to simple ADSC treatment．The possible mechanism may be related to DHT up-regulate BDNF and TrkB expression in the lesion area in spinal cord and to promote ADSC survival．

Testosterone；Adipose-derived stem cell；Spinal cord injury；BDNF；TrkB

國家自然科學(xué)基金(81371362)；黑龍江省衛(wèi)生計生委立項科研課題(2016-357)

R-332

A

1673-5110(2017)05-0017-04