大麻制劑HU210對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎的干預(yù)作用及其與Toll樣受體4信號(hào)通路的可能關(guān)系*

張瑞琴， 林思思， 李 敏， 沈 利， 李 琨， 李永渝△

(1同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，消化系統(tǒng)疾病研究所，上海 200092； 2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院西院病理科，山西 太原 030053； 3遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校生理教研室，貴州 遵義 563000； 4同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，上海 200092)

大麻制劑HU210對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎的干預(yù)作用及其與Toll樣受體4信號(hào)通路的可能關(guān)系*

張瑞琴1,2， 林思思1， 李 敏3， 沈 利4， 李 琨1， 李永渝1△

(1同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，消化系統(tǒng)疾病研究所，上海 200092；2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院西院病理科，山西 太原 030053；3遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校生理教研室，貴州 遵義 563000；4同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，上海 200092)

目的： 研究大麻類制劑HU210對(duì)雨蛙肽(caerulein，CAE)誘導(dǎo)的野生型(wild-type，WT)和Toll樣受體4基因敲除(tlr4-/-)小鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的干預(yù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法: 將成年C57BL/10J小鼠及相同背景的tlr4-/-小鼠各隨機(jī)分成3組： AP組、AP+HU210組及正常對(duì)照組。小鼠腹腔注射CAE(50 μg·kg-1·h-1)6次及脂多糖(10 mg/kg)1次復(fù)制AP模型；AP+HU210組在造模前及造模后各腹腔注射1次HU210(50 μg/kg)；對(duì)照組注射生理鹽水替代CAE和脂多糖。造模處理后3 h，取血處死小鼠，取胰腺、肺組織及腸道Peyer’s結(jié)。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，無(wú)論在WT或tlr4-/-小鼠，AP造模后胰腺病理評(píng)分，血漿淀粉酶活性，血漿IL-6、TNF-α及MCP-1水平，以及肺MPO活性均明顯升高(P<0.05)，P38蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。同時(shí)，AP造模后，與WT小鼠相比，tlr4-/-小鼠血漿IL-6、TNF-α及MCP-1水平，以及胰腺P38及p-P38蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，Peyer’s結(jié)CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯降低(P<0.05)。 HU210干預(yù)使2種小鼠AP模型的胰腺病理學(xué)評(píng)分和肺MPO活性的升高明顯得到改善(P<0.05)；在WT小鼠，而非tlr4-/-小鼠，AP引起的血漿淀粉酶活性和胰腺P38及p-P38蛋白表達(dá)的變化在HU210干預(yù)后明顯逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。結(jié)論: TLR4主要參與AP全身炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能依賴TLR4-P38 MAPK信號(hào)通路；大麻制劑HU210對(duì)AP的干預(yù)主要通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)發(fā)揮組織保護(hù)作用，與TLR4信號(hào)通路的關(guān)系似乎不明顯。

急性胰腺炎； 大麻素類； Toll樣受體4； 炎癥介質(zhì)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是發(fā)生在胰腺的一種常見(jiàn)的炎癥性疾病，多數(shù)患者的病變局限于胰腺及胰腺周圍組織，約20%的患者由于并發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，導(dǎo)致該疾病死亡率高達(dá)30%[1]。AP的發(fā)病機(jī)制涉及到多因素、多環(huán)節(jié)，已有的學(xué)說(shuō)包括“胰酶自身消化學(xué)說(shuō)”、“炎癥因子學(xué)說(shuō)”、“氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)”、“腸道細(xì)菌移位學(xué)說(shuō)”等等[2]。其中，大量研究關(guān)注到疾病發(fā)病過(guò)程中多種炎癥因子的作用，有大量研究表明，白細(xì)胞介素6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)及單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)等炎癥因子參與AP發(fā)生發(fā)展，與AP引起的并發(fā)癥有著密切的聯(lián)系[3]。研究還揭示，多條細(xì)胞信號(hào)通路涉及AP的炎癥反應(yīng)，其中包括Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)信號(hào)通路，這些通路的激活參與了AP時(shí)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放以及炎癥的擴(kuò)布[4-5]。

大麻類物質(zhì)用于治療炎癥性疾病已有上千年的歷史，由于中樞神經(jīng)的副作用使其應(yīng)用受到限制。近20年來(lái)，隨著內(nèi)源性大麻系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)、人工合成大麻制劑的問(wèn)世及對(duì)AP發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，使得人們將目光關(guān)注到此類制劑在臨床治療上的可能性和有效性。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，選用人工合成的大麻制劑HU210，用野生型(wild-type, WT)和tlr4基因敲除(tlr4-/-)小鼠，通過(guò)對(duì)胰腺組織病理評(píng)分、胰酶活性、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子水平以及腸道Peyer’s 結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，進(jìn)一步探討AP的發(fā)病機(jī)制和HU210對(duì)AP的作用及其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動(dòng)物 成年tlr4-/-小鼠及其相同背景的C57BL/10J野生型小鼠各24只，體重25～30 g，雌雄各半，購(gòu)自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物處于溫度(23±2)℃、濕度(50～60)%環(huán)境中，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食、自由飲水喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及藥物 雨蛙肽(caerulein, CAE)及脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購(gòu)自Sigma；HU210購(gòu)自Tocris Bioscience，使用時(shí)溶于溶劑(無(wú)水乙醇∶Tween 80∶生理鹽水=1∶1∶18)；淀粉酶和髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TNF-α和IL-6試劑盒購(gòu)自R&D Systems；MCP-1試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)公司；免疫組化抗體(P38α多克隆抗體和p-P38多克隆抗體)購(gòu)自CST；流式抗體(CD3-PerCP、CD4-FITC和CD8-PE抗體)購(gòu)自BioLegend。

2 方法

2.1 AP模型構(gòu)建及分組 實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h，參照Ding等[6]的方法復(fù)制AP模型。WT和tlr4-/-小鼠隨機(jī)各分為3組，每組8只：(1)AP組，小鼠腹腔注射雨蛙肽50 μg/kg，每小時(shí)1次，連續(xù)注射6次，末次加注脂多糖10 mg/kg；(2)AP+HU210組，AP造模方法同前，在造模前及造模后用HU210(50 μg/kg)腹腔注射各1次(AP組注射溶劑)；(3)對(duì)照(control，CON)組使用相同次數(shù)和劑量的生理鹽水替代雨蛙肽和脂多糖。末次腹腔注射后3 h將小鼠處死，收集血漿、胰腺、肺及腸道Peyer’s結(jié)。

2.2 胰腺組織病理學(xué)評(píng)估 將胰腺組織置入4%甲醛固定液過(guò)夜，再進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、組織切片、HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織病理改變，請(qǐng)專業(yè)病理醫(yī)師閱片及評(píng)分(標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7])。簡(jiǎn)言之，水腫評(píng)分如下：0，無(wú)水腫；1，小葉間水腫；2，腺泡腫脹，小葉間隙增大；3，明顯小葉分隔。炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分：0，無(wú)浸潤(rùn)；1,炎細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)管內(nèi)；2，炎細(xì)胞浸潤(rùn)<50%；3，炎細(xì)胞浸潤(rùn)>50%。壞死評(píng)分：0，無(wú)壞死；1，點(diǎn)狀壞死<5%；2，灶狀壞死5%～20%；3，彌漫性壞死>20%。最后病理評(píng)分分值范圍0～9。

2.3 血漿淀粉酶活性及炎癥介質(zhì)水平檢測(cè) 放入抗凝管的血液離心取上清液。血漿淀粉酶按照生化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。TNF-α、IL-6及MCP-1按照ELISA試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 肺組織MPO活性檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配成5%的肺組織勻漿，靜置后取上清液按要求進(jìn)行操作，計(jì)算單位組織濕重的MPO活性。

2.5 胰腺組織中P38及p-P38的蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，石蠟切片脫蠟至水，使用染色試劑盒(Bioss)按要求操作，加P38α多克隆抗體(1∶40稀釋)或p-P38多克隆抗體(1∶25稀釋)4 ℃過(guò)夜，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體37 ℃孵育1 h，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育1 h，DAB(Boster)顯色，20 min后蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取，結(jié)果以對(duì)照組的值為100%，AP組和AP+HU210組的值分別以相應(yīng)對(duì)照組的百分比表示。

2.6 小腸Peyer’s結(jié)的T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 參照李敏等[8]介紹的方法機(jī)械分離取小腸Peyer’s結(jié)，加入1 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline, PBS)碾磨后收集細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取10 μL 1×109/L細(xì)胞懸液血清封閉后加入100 μL熒光活化細(xì)胞分選緩沖液(fluorescence-activated cell sorting buffer, FACS buffer；由PBS、5%小牛血清和1%疊氮鈉按照18∶1∶1配成)和0.5 μL CD3-PerCP、0.25 μL CD4-FITC、0.5 μL CD8-PE抗體混合液，剩余的細(xì)胞懸液混合后等量分裝，血清封閉后分別單獨(dú)加入FACS buffer及上述3種抗體之一，避光4 ℃孵育30 min。離心機(jī)設(shè)置1 500 r/min離心5 min，棄上清加200 μL PBS，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)后使用FlowJo 7.6采集數(shù)據(jù)，結(jié)果以測(cè)得的細(xì)胞數(shù)占T淋巴細(xì)胞百分比表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或者均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。tlr4-/-或WT小鼠各組間分別進(jìn)行單因素方差分析，若方差齊，用LSD法兩兩比較，若方差不齊，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。觀察兩種小鼠AP組之間和AP+HU210組之間的差異，采用雙因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胰腺組織病理學(xué)的變化

光鏡下，WT和tlr4-/-小鼠的正常胰腺組織腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管排列緊密，AP造模后胰腺腺泡細(xì)胞壞死，間質(zhì)明顯水腫、出血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病理學(xué)評(píng)分較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。HU210干預(yù)使2種AP小鼠的胰腺組織水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，病理學(xué)評(píng)分較各自AP組明顯降低(P<0.01)。AP時(shí)胰腺組織病理學(xué)變化及HU210的干預(yù)效果在WT和tlr4-/-小鼠之間無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖1A、B。

2 血漿淀粉酶活性的變化

如圖1C所示，與對(duì)照組相比，AP組WT和tlr4-/-小鼠血漿淀粉酶活性顯著升高(P<0.01)；HU210干預(yù)后，WT小鼠血漿淀粉酶活性明顯下降(P<0.05)，tlr4-/-小鼠的變化不顯著。

Figure 1.Effects of HU210 treatment on the severity of AP in WT andtlr4-/-mice. A： the pathological images of pancreas (HE staining, ×400)； B： the pathological scores of pancreas； C： the amylase activity in plasma. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol (CON) group;#P<0.05,##P<0.01vsAP group.

圖1 HU210對(duì)急性胰腺炎WT和tlr4-/-小鼠胰腺病理及血漿淀粉酶活性的影響

3 血漿IL-6、TNF-α及MCP-1水平的變化

AP組WT和tlr4-/-小鼠血漿IL-6、TNF-α和MCP-1水平均較各自對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，HU210干預(yù)未見(jiàn)明顯降低作用。然而，值得注意的是，與WT小鼠相同處理組比較，tlr4-/-小鼠AP組或AP+HU210組，其血漿IL-6、TNF-α和MCP-1水平均明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Effects of HU210 treatment on IL-6 (A), TNF-α (B) and MCP-1 (C) levels in plasma in WT andtlr4-/-mice with AP. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol (CON) group；△△P<0.01vsWT.

圖2 HU210對(duì)急性胰腺炎WT和tlr4-/-小鼠血漿炎癥介質(zhì)水平的影響

4 肺組織髓過(guò)氧化物酶活性的變化

如圖3所示，無(wú)論WT或tlr4-/-小鼠，AP造模后其肺組織MPO活性較對(duì)照組明顯增高(P<0.01)。HU210干預(yù)明顯降低肺MPO活性(P<0.05)，表明HU210減輕AP時(shí)肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。AP組tlr4-/-小鼠肺MPO活性較WT小鼠有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 3.Effect of HU210 treatment on lung MPO activity in WT andtlr4-/-mice with AP. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol (CON) group;#P<0.05vsAP group.

圖3 HU210對(duì)急性胰腺炎WT和tlr4-/-小鼠肺MPO活性的影響

5 胰腺組織中P38及p-P38蛋白表達(dá)的變化

與對(duì)照組相比，AP造模后，在WT小鼠，胰腺P38和p-P38蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，大麻制劑HU210明顯降低這些變化(P<0.05)；而在tlr4-/-小鼠，AP組胰腺P38蛋白、而非p-P38蛋白表達(dá)較對(duì)照組有所增高(P<0.05)，HU210對(duì)此無(wú)明顯影響。有趣的是，與AP組WT小鼠相比，AP組tlr4-/-小鼠胰腺P38和p-P38蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

6 小腸Peyer’s結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的變化

在WT小鼠，與對(duì)照組相比，AP組小腸Peyer’s結(jié)中CD3+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞比例有所減少，CD4+/CD8+比值明顯降低(P<0.01)；在tlr4-/-小鼠，AP組的小腸Peyer’s結(jié)中淋巴細(xì)胞變化不大，與WT小鼠AP組的變化比較，差異顯著(P<0.05)。HU210干預(yù)對(duì)WT或tlr4-/-小鼠小腸Peyer’s結(jié)中淋巴細(xì)胞的影響均不明顯，見(jiàn)圖5。

討 論

AP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及機(jī)體調(diào)控因素眾多。本實(shí)驗(yàn)采用雨蛙肽，一種膽囊收縮素(cholecystokinin, CCK)的類似物，當(dāng)大劑量注射時(shí)可通過(guò)促進(jìn)胰酶過(guò)度分泌而誘導(dǎo)AP發(fā)生。LPS為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是TLR4的配體，通過(guò)TLR4信號(hào)通路，引起體內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等活化，促進(jìn)釋放白細(xì)胞介素1、6、8和TNF-α、組胺等生物活性物質(zhì)，使小血管損傷、管壁擴(kuò)張，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，進(jìn)而加重胰腺病變。我們參照Ding等[6]的方法，對(duì)小鼠腹腔注射CAE+LPS來(lái)復(fù)制AP模型，觀察到胰腺組織水腫、出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀腺泡細(xì)胞壞死，血漿淀粉酶活性增加，增多的促炎細(xì)胞因子釋放入血，肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)，均為重型AP的表現(xiàn)。

Figure 4.Effects of HU210 on pancreatic P38 (A) and p-P38 (B) protein expression in WT andtlr4-/-mice with AP (immunohistochemical staining，×400). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (CON) group;#P<0.05vsAP group；△P<0.05vsWT.

圖4 HU210對(duì)WT和tlr4-/-小鼠急性胰腺炎胰腺P38和p-P38蛋白表達(dá)的影響

已知，炎癥反應(yīng)本質(zhì)上是一種機(jī)體對(duì)抗致病因子的一系列抗損傷過(guò)程，涉及多因素、多系統(tǒng)的參與。然而過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)加重組織細(xì)胞的損傷。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是生物進(jìn)化過(guò)程中一種古老的天然免疫受體，也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的跨膜蛋白[9]。TLR4是TLR家族的一員，主要識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分LPS，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)活化P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)以及核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)，促使促炎細(xì)胞因子的合成和釋放。目前，TLR4在AP的發(fā)病機(jī)制的作用仍存在爭(zhēng)議。一些研究認(rèn)為TLR4除分布于免疫相關(guān)細(xì)胞，還分布于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及胰島細(xì)胞的細(xì)胞膜上，CAE誘導(dǎo)的AP胰腺TLR4mRNA表達(dá)上調(diào)，TNF-α、IL-6和IL-2水平升高[10]，而通過(guò)抑制TLR4可以降低炎癥介質(zhì)[11]。另有研究表明TLR4在CAE誘導(dǎo)的AP中對(duì)胰腺組織損傷及AP相關(guān)肺損傷無(wú)明顯作用[12]。Sawa等[13]認(rèn)為TLR4缺陷對(duì)十二指腸閉合術(shù)誘導(dǎo)的AP胰腺組織無(wú)影響，但可減輕AP相關(guān)的肝和腎損傷。在本課題組的前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)AP時(shí)，TLR4的下游信號(hào)分子P38 MAPK及其磷酸化形式在胰腺組織表達(dá)增加，而使用P38 MAPK抑制劑SB203580抑制其活化，可明顯降低炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子水平[14]。本實(shí)驗(yàn)我們選用tlr4基因敲除小鼠探討TLR4在AP發(fā)病機(jī)制的作用，看到AP WT小鼠血漿IL-6和TNF-α水平約為tlr4基因缺陷小鼠的4倍，MCP-1的水平約為tlr4基因缺陷小鼠的45倍。同時(shí)P38 MAPK作為TLR4的下游信號(hào)分子，tlr4基因的缺陷使得P38及其磷酸化形式p-P38蛋白表達(dá)相應(yīng)地下降，結(jié)果表明TLR4-P38 MAPK信號(hào)通路參與AP，尤其是伴有內(nèi)毒素血癥時(shí)的全身炎癥反應(yīng)。

Figure 5.Changes of T-lymphocyte subsets in the intestinal Peyer’s patches of WT andtlr4-/-mice with AP after HU210 treatment detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vsWT.

圖5 WT和tlr4-/-小鼠各組腸道Peyer’s結(jié)中CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值的變化

機(jī)體的炎癥反應(yīng)調(diào)控涉及多系統(tǒng)、多器官。20世紀(jì)90年代，Marzo等[15]首次提出內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system, ECS)，該系統(tǒng)由內(nèi)源性大麻素物質(zhì)、大麻素受體[主要包括大麻素受體1(cannabinoid receptor 1, CB1)和大麻素受體2(cannabinoid receptor 2, CB2)]，以及參與內(nèi)源性大麻素物質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解的酶類組成。最近大量研究顯示，ECS廣泛參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、包括AP以及其它胃腸道炎癥疾病的調(diào)控[16-18]。CB2主要通過(guò)調(diào)控P38 MAPK信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子的合成和釋放，該受體的激活具有抗炎作用[19]。Michalski等[16]發(fā)現(xiàn)AP患者胰腺組織CB受體表達(dá)上調(diào)，內(nèi)源性大麻素物質(zhì)水平升高；此外，人工合成的CB1/CB2受體激動(dòng)劑HU210治療小鼠實(shí)驗(yàn)性AP，減緩AP相關(guān)性疼痛，減輕炎癥反應(yīng)和胰腺病理?yè)p傷，而不伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。Michler等[20]研究證實(shí)，HU210主要是通過(guò)活化CB2減輕AP的胰腺組織損傷和肺組織MPO活性。本課題組之前的研究證實(shí)HU210通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)及減少胃泌素和胃蛋白酶分泌，可以保護(hù)胃組織抵抗AP引起的急性胃腸黏膜病變[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HU210干預(yù)AP小鼠，使其胰腺組織損傷減輕，血漿淀粉酶活性及肺組織MPO活性降低，胰腺組織P38和p-P38的表達(dá)下調(diào)。大麻制劑HU210作為CB受體激動(dòng)劑，參與激活ECS而發(fā)揮對(duì)AP的干預(yù)作用，其作用機(jī)制是否與其抑制TLR4-P38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)？從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看到，無(wú)論對(duì)WT或tlr4基因敲除小鼠，HU210均可明顯改善AP胰腺組織病理改變、降低肺部炎細(xì)胞浸潤(rùn)；而對(duì)于AP時(shí)的高胰淀粉酶血癥及上調(diào)的P38和p-P38，HU210的對(duì)抗作用僅在WT鼠明顯表現(xiàn)出來(lái)，對(duì)tlr4基因敲除鼠無(wú)影響，說(shuō)明HU210改善 AP組織病理和功能損傷的作用主要是通過(guò)抑制組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，而不依賴TLR4-P38 MAPK信號(hào)通路。另外，無(wú)論WT或tlr4基因敲除小鼠，HU210對(duì)CAE+LPS引起的小鼠重癥AP其顯著升高的血漿炎癥介質(zhì)水平無(wú)明顯逆轉(zhuǎn)，提示HU210對(duì)AP全身炎癥因子的表達(dá)無(wú)明顯作用，說(shuō)明合并內(nèi)毒素血癥的重癥AP其機(jī)體炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重性和復(fù)雜性，其中涉及多因素、多系統(tǒng)的參與。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示TLR4-P38 MAPK信號(hào)通路參與AP，尤其是伴有內(nèi)毒素血癥時(shí)的全身炎癥反應(yīng)。大麻制劑HU210對(duì)AP組織的保護(hù)作用，可能主要是通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞，尤其是抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，對(duì) TLR4信號(hào)通路的依賴不明顯。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of cannabinoid HU210 on experimental acute pancreatitis and possible relationship with Toll-like receptor 4 signaling pathway

ZHANG Rui-qin1, 2, LIN Si-si1, LI Min3, SHEN Li4, LI Kun1, LI Yong-yu1

(1DepartmentofPathophysiology,InstituteofDigestiveDisease,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China;2DepartmentofPathology,WestBranchofTheSecondHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030053,China;3DepartmentofPhysiology,ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi563000,China;4DepartmentofPathogenBiology,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:liyongyu@tongji.edu.cn)

AIM: Using Toll-like receptor 4 gene knockout (tlr4-/-) mice and the wild-type (WT) mice with the same C57BL/10J genetic background, the effects of HU210, a cannabis preparation, on caerulein (CAE)-induced acute pancreatitis (AP) and the potential mechanisms were investigated. METHODS: WT ortlr4-/-mice were randomly divided into AP group, AP+HU210 group and control group. AP was induced by intraperitoneal injection of CAE (50 μg·kg-1·h-1) for a total of 6 times and lipopolysaccharide (LPS) at 10 mg/kg 6 h after the first injection of CAE. HU210 (50 μg/kg) was given 30 min before and 4 h after the first injection of CAE in AP+HU210 group. The animals in control group were given normal saline instead of CAE and LPS in the same way. The mice were sacrificed 3 h after the last injection. The blood, the pancreas, the lungs and the intestinal Peyer’s patches were harvested. RESULTS: Compared with control group, the pancreatic pathological score and P38 protein expression, plasma amylase activity and inflammatory mediator levels, and lung MPO activity were significant increased (P<0.05) in both WT andtlr4-/-mice with AP. Compared with the WT mice with AP, thetlr4-/-mice with AP showed significantly low levels of IL-6, TNF-α and MCP-1 in the plasma, low expression levels of pancreatic P38 and p-P38 protein (P<0.05), and mild alterations of CD3+T-lymphocytes, CD4+T-lymphocytes and the ratio of CD4+/CD8+(P<0.05). The administration of HU210 attenuated the pancreatic pathological changes and the lung MPO activity in both stains of mice with AP (P<0.05). However, the inhi-bitory effects of HU210 on the increased amylase activity in the plasma and the increased protein levels of pancreatic P38 and p-P38 were remarkable (P<0.05) in WT mice instead of intlr4-/-mice. CONCLUSION: TLR4 is mainly involved in AP-related systemic inflammatory response and its mechanism may be dependent on TLR4-P38 MAPK signaling pathway. The intervention of HU210 in AP plays a protective role mainly by inhibiting the infiltration of inflammatory cells, and the relationship with TLR4 signaling pathway is not obvious.

Acute pancreatitis; Cannabinoids; Toll-like receptor 4; Inflammatory mediators

1000- 4718(2017)06- 1112- 07

2016- 11- 28

2017- 03- 15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270477; No.31571181)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.025

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