從脊柱內鏡手術摘除組織中分離髓核間充質干細胞及其生物學特征鑒定*

尚玉攀， 吳 昊， 曾曉麗, 鄭力恒， 余 俊， 肖黔龍， 屠 美, 張嘉晴△

(暨南大學 1附屬第一醫院骨科， 2基礎醫學院生物化學與分子生物學系， 3理工學院生物材料系， 廣東 廣州 510632； 4仁伯爵綜合醫院， 澳門醫學科技研究協會， 中國 澳門 999078)

從脊柱內鏡手術摘除組織中分離髓核間充質干細胞及其生物學特征鑒定*

尚玉攀2， 吳 昊1， 曾曉麗2, 鄭力恒4， 余 俊2， 肖黔龍2， 屠 美3, 張嘉晴2△

(暨南大學1附屬第一醫院骨科，2基礎醫學院生物化學與分子生物學系，3理工學院生物材料系， 廣東 廣州 510632；4仁伯爵綜合醫院， 澳門醫學科技研究協會， 中國 澳門 999078)

目的： 利用經皮內鏡下腰椎間盤切除術獲取來源明確的髓核組織，結合組織塊培養法高效分離培養人髓核間充質干細胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells，hNP-MSCs), 并鑒定其生物學特征。方法: 收集6例腰間盤突出癥手術摘除的髓核組織，利用組織塊培養法分離培養。取第3～6代生長良好的細胞用于實驗，采用CCK-8檢測增殖能力；用流式細胞術檢測細胞表面標志物；并分別向成骨、成脂和成軟骨方向誘導分化，用油紅O染色、茜素紅染色及阿利新藍染色對分化結果進行檢測。結果: 成功從椎間盤內鏡摘除的髓核組織中分離培養具有增殖能力的細胞，流式細胞術檢測顯示細胞高表達CD29、CD44、CD90、CD73和CD105等間充質干細胞抗原，不表達造血干細胞標志CD34和CD45。生長曲線顯示符合正常間充質干細胞增殖特征。茜素紅染色、阿利新藍染色及油紅O染色均呈陽性，說明分離培養的細胞具有向成骨、成軟骨和成脂肪誘導分化的能力。結論: 首次結合椎間盤內鏡微創手術和組織塊培養法，體外高效分離培養了具有自我更新能力和多向分化潛能的hNP-MSCs。

經皮內鏡下腰椎間盤切除術； 組織塊培養法； 人髓核間充質干細胞

近年來，椎間盤退變及其引起的下腰痛發病率逐年升高，已成為45歲以下的人群失去勞動力或勞動力下降的主要原因之一，給社會經濟帶來沉重的負擔[1]。目前治療椎間盤退變的方法僅只能暫時減輕或緩解疼痛癥狀，并不能從根本上逆轉椎間盤退變的病理過程，還有加重病情的風險[2]。以間充質干細胞為基礎的組織工程技術為退變椎間盤進行再生和修復帶來了新的希望，成為目前最有潛力的治療途徑[3-5]。然而，對人類椎間盤髓核干細胞缺乏足夠了解，是阻礙這一技術發展的主要原因。近年來研究發現，椎間盤髓核組織內存在一種可貼壁生長、表達一系列間充質干細胞表面標志物、可三系誘導分化的細胞。該細胞滿足國際細胞治療學會(International Society for Cellular Therapy，ISCT)提出的間充質干細胞判定準則[6]，被命名為人髓核間充質干細胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells，hNP-MSCs)。由于人類髓核組織獲取來源極其有限，目前NP-MSCs的研究數據主要來自于動物實驗[7-9]，但是動物數據的翻譯解釋對應到人類細胞研究有其不可克服的局限性。

目前絕大多數文獻采用酶消化法分離脊柱開放手術摘除組織來獲取hNP-MSCs。由于開放手術難以對髓核和其它組織進行精細分離，摘除組織往往夾雜有髓核周圍的纖維軟骨組織或韌帶組織，造成細胞來源混雜。酶消化法單獨采用Ⅱ型膠原酶或結合Ⅰ型膠原酶將手術摘取組織置于37 ℃下消化5 h 左右[10-11]，存在著步驟繁瑣、失敗率高、費用昂貴等缺陷[12]。而分離間充質干細胞有另一種方法，即組織塊培養法[13-14]。相比酶消化法，組織塊培養法操作時間較短且步驟更簡便[15]。然而目前尚未見運用組織塊培養法分離培養髓核間充質干細胞的報道。鑒于酶消化法分離hNP-MSCs的方法成功率低，細胞數量少，細胞活性受影響，已嚴重制約hNP-MSCs研究發展，本研究首次結合椎間盤內鏡微創手術和組織塊培養法，探索新型高效體外分離培養hNP-MSCs的方法并對獲取細胞進行生物學特征鑒定，為促進椎間盤退變的細胞治療提供新的實驗方法和理論基礎。

材 料 和 方 法

1 人髓核組織的獲取

標本來源于暨南大學附屬第一醫院骨科收治的6例L4/5～L5S1腰椎間盤突出癥患者，年齡19～49歲，手術方式為經皮內鏡下腰椎間盤切除術。本研究經院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

2 主要儀器試劑

DMEM/F12培養基和胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶(Sigma)；CCK-8(Kumamoto)；青霉素和鏈霉素(HyClone)；人MSCs 成骨誘導試劑盒、成軟骨誘導試劑盒、成脂誘導試劑盒(Cyagen)；酶標儀(Lecia)；L-谷氨酰胺(Sigma)。

3 組織塊培養法分離獲取NP-MSCs

無菌條件下用 PBS 清洗人髓核組織3遍，齒鑷及眼科剪將髓核組織剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，然后使用吸管將組織塊逐一種植入預先用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基浸泡過的T25培養瓶內，密度大概為20～25塊/瓶。放置在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。3 h后，待組織塊完全貼到培養瓶上，加入2 mL含20%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養基，此后每隔2天換液1次。觀察貼壁組織周圍的細胞生長情況，當細胞達到80%～90%融合度時，用胰蛋白酶消化傳代。

4 細胞形態學觀察

hNP-MSCs按照5×104/cm2接種于6孔板，培養后每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化及生長狀況并拍照。

5 流式細胞術檢測細胞表面因子

取第3代長勢良好的NP-MSCs，待細胞生長至融合時收集細胞，調整細胞密度為1×109/L保存在1.5 mL的EP管中；每管中分別加入相應hNP-MSCs表面因子 CD29、CD44、CD90、CD73、CD105、CD34和CD45的抗體各10 μL，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析結果。

6 hNP-MSCs增殖能力的檢測

取第3代的hNP-MSCs，細胞計數后調整細胞懸液密度，按照每孔4×104細胞、500 μL培養基接種于24孔板，每組3個復孔。以不含細胞的培養液為空白對照。將24孔板放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中孵育培養，分別于接種后1、3、5、7、9、11和13 d檢測細胞的增殖情況。每到一個時點，抽出一個橫向試驗，向每孔小心加入50 μL CCK-8溶液，孵育2 h后用檢測波長為450 nm的酶標儀測定吸光度(A)值，繪制細胞增殖曲線。

7 hNP-MSCs的三系分化

7.1 成脂誘導分化 取第3代的hNP-MSCs細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化以后，調整細胞密度為1×109/L均勻接種于6孔板中，用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養液培養,直至細胞生長達到95%融合，將培養液更換成成脂誘導培養液。成脂誘導培養基為：含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養基中添加0.5 mmol/L地塞米松、10 μmol/L胰島素和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤。每隔2 d更換1次成脂誘導液。誘導3周后進行油紅O染色[16]，并進行拍照保存。

7.2 成骨誘導分化 取第3代的hNP-MSCs，0.25%的胰蛋白酶消化以后，調整細胞密度為1×109/L均勻接種于6孔板中，用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養液培養培養至70%融合后，將培養液更換為成骨誘導培養液。成骨誘導培養基為：含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的低糖DMEM培養基，并添加10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L維生素C。對照組中添加常規培養基。每隔2 d更換1次成骨誘導液。誘導培養3周后用茜素紅S進行染色[16]，并拍照保存。

7.3 成軟骨誘導分化 取第3代的hNP-MSCs，0.25%的胰蛋白酶消化以后，調整細胞密度為1×109/L 均勻接種于6孔板中，用含10%特級胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養液培養培養至 90%以上融合后，將培養液更換為成軟骨誘導培養液。成軟骨誘導培養基為：含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養基添加0.1 μmol /L地塞米松、10 μg/L TGF-β1、6.25 mg/L轉鐵蛋白、6.25 mg/L胰島素和50 mg/L維生素C。對照組中添加常規培養基。每隔2 d更換1次成軟骨誘導液。誘導培養3周后用阿利新藍進行染色，并拍照保存。

結 果

1 人髓核組織標本大體情況

本實驗6例患者均順利完成椎間盤內鏡微創手術摘取退變髓核組織，由于手術視野無出血，組織辨別清晰，利用生理鹽水使標本基本保持原本的形態和理化特性。術中將取出的標本分為髓核組織、纖維環組織和韌帶組織。髓核組織為白色粘彈性物質，退變的髓核組織呈破棉花絮狀，正常的髓核組織呈膠凍狀，較年輕患者膠凍狀態更加明顯。纖維環組織和韌帶組織鏡下可辨別，質地較韌，不予保留。每例患者均取到髓核組織有20～40 g，見圖1。

Figure 1.Percutaneous endoscopic lumbar discectomy removal of nucleus pulposus tissues.

圖1 從脊柱內鏡微創手術摘除的髓核組織

2 人髓核間充質干細胞的生物學特性

經光學倒置顯微鏡觀察，組織塊接種7 d后，組織塊周圍可見零星的一些細胞游出，形態多為梭形。10～12 d，有更多的細胞從組織塊中游出，細胞大小較均一，形態多為典型的長梭形，少數為多角形，向四周呈單層貼壁生長。15 d后，去除組織塊，細胞達到90%左右的融合。細胞傳至第3代時，形態變為均一的梭形，均呈現紡錘樣長梭形，見圖2。

Figure 2.Morphology of human nucleus pulposus mesenchymal stem cells (×100)．A， B: passage 0; C: passage 3.

圖2 不同代的人髓核間充質干細胞形態

3 人髓核間充質干細胞的表面標志

流式細胞術檢測結果顯示，培養至第三代的hNP-MSCs表面因子 CD29、CD44、CD90、CD73和CD105呈陽性表達，其陽性率分別是100%、100%、100%、99.96%和99.99%；而CD34和CD45呈陰性表達，其陽性率分別為0.55%和0.46%，見圖3。

Figure 3.The flow cytometry results of cell surface markers on hNPMSCs at passage 3．

圖3 流式細胞術檢測 hNP-MSCs 表面因子表達

4 細胞增殖能力

由生長曲線可知，細胞傳代后前5 d增殖不是很明顯，5～7 d進入對數生長期，8～13 d開始增殖緩慢。正常細胞量傳代后，4～5 d即可傳代1次，而本實驗做細胞增殖能力檢測時，為更準確觀察細胞增殖過程，細胞種植密度低，13 d后進入平臺期，見圖4。

Figure 4.Growth curve detection of passage 3 human nucleus pulposus mesenchymal stem cells

圖4 第3代人髓核間充質干細胞的生長曲線

5 成脂誘導分化情況

hNP-MSCs用成脂誘導培養基培養5 d后，細胞慢慢開始形變，細胞內部出現微小的脂滴，肉眼可見，隨著誘導時間的延長，細胞內的脂滴越來越多，越來越大。此時，形變成脂肪細胞的數目也隨之增多，誘導3周后，油紅O染色，細胞內可見大量的紅染顆粒，見圖5A。

6 成骨誘導分化情況

在更換成骨誘導液1周左右，普通倒置顯微鏡下可以觀察到部分細胞發生了形變，呈圓形狀大概誘導至第10天左右，會出現絮狀物沉積在細胞表面，隨著成骨誘導時間的延長，沉積物質越來越多，誘導3周后對細胞進行茜素紅S染色鑒定并拍照，結果見圖5B。

7 成軟骨誘導分化情況

在更換成軟骨誘導液21 d后，阿利新藍染色結果顯示，hNP-MSCs成軟骨誘導后，染色呈強陽性，細胞外基質被染成藍色，見圖5C。

討 論

本研究獲取6例行脊柱內鏡微創手術的髓核組織，通過組織塊貼壁培養，5～7 d可在光鏡下觀察到細胞從組織塊中移行出來，形態多為長梭形。經流式細胞術檢測，高表達間充質干細胞特異性表面抗原 CD29、CD44、CD90、CD73和CD105(皆高于99%)，不表達造血干細胞標志CD34和CD45(<1%)，根據ISCT標準，完全符合間充質干細胞的特征[6]。CCK-8法檢測結果顯示第3代人髓核間充質干細胞的生長曲線呈典型的S形，符合干細胞的生長規律[17]，且具有較好的增殖能力。進一步對多向分化潛能檢測，結果表明成脂誘導3周時油紅O染色，細胞內出現大量的紅染顆粒，證實培養的細胞能夠向脂肪細胞分化。這與之前認為hNP-MSCs不能分化為脂肪細胞的報道截然不同[18]。此外，成骨與成軟骨誘導分化實驗結果證實所分離培養的細胞能夠向成骨及成軟骨細胞方向分化。說明本實驗分離出的hNP-MSCs具有較高的多向分化潛能。

Figure 5.Multilineage differentiation of hNP-MSCs. A: oil red O staining after adipogenic induction (×200)； B: alizarin red staining after osteogenic induction (×100)； C: alcian blue staining after chondrogenic induction (×200).

圖5 第3代hNP-MSCs的成脂、成骨和成軟骨分化

本研究首次將組織塊培養法結合脊柱內鏡微創手術獲取髓核組織，運用到hNP-MSCs分離培養研究中，獲得了具有間充質干細胞形態的、可持續擴增的髓核來源的細胞。經流式細胞術分析和多向分化潛能鑒定，所分離細胞符合國際間充質干細胞標準。而且不使用消化酶，細胞狀態更好。本研究所用的方法大大減少了實驗操作步驟，將實驗時間從5 h縮短到1 h，同時降低了難度。節約了成本，且收獲的原代細胞產量較酶消化法更多，能夠很好地保持髓核間充質干細胞的生物學特性。更重要的是，本研究首次探索利用脊柱內鏡微創手術獲取髓核組織，通過高分辨率的視鏡系統對組織準確分離，精確去除纖維環軟骨和韌帶組織，克服了開放手術來源的標本混雜其它組織的缺陷，有利于細胞純化。此外，研究發現hNP-MSCs的生物活性可能與髓核組織退變程度密切相關[19]。本研究可通過微創手術高分辯內鏡系統對髓核組織進行在體觀察，結合術前影像學更準確地評估椎間盤退變的程度，為研究hNP-MSCs活性與椎間盤退變程度之間的關系提供更可靠的實驗依據。

總之，本研究首次將組織塊培養法結合脊柱內鏡微創手術獲取髓核組織，運用到hNP-MSCs分離培養研究中，為基于hNP-MSCs的再生醫學和組織工程研究提供新的實驗方法和理論基礎。

[1] Dagenais S, Caro J, Haldeman S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally[J]. Spine J, 2008, 8(1):8-20.

[2] Levin DA, Hale JJ, Bendo JA. Adjacent segment degeneration following spinal fusion for degenerative disc disease [J]. Bull NYU Hosp Jt Dis, 2007, 65(1): 29-36.

[3] Wang F, Wu X, Wang Y, et al. Research situation of stem cells transplantation for intervertebral disc degeneration [J]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi, 2013, 27(5): 575-579.

[4] Comes ME, Bossano CM, Johnston CM, et al.Invitrolocalization of bone growth factors in constructs of biodegra-dable scaffolds seeded with marrow stromal cells and cultured in a flow perfusion bioreactod[J]. Tissue Eng, 2006, 12(1): 177-188.

[5] Smith LJ, Chiaro JA, Nerurkar NL, et al. Nucleus pulposus cells synthesize a functional extracellular matrix and respond to inflammatory cytokine challenge following long-term agarose culture[J]．Eur Cell Mater, 2011, 22: 291-301.

[6] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement [J]. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.

[7] Larson JW 3rd, Levicoff EA, Gilbertson LG， et al. Biologic modification of animal models of intervertebral disc degeneration [J]. J Bone Joint Surg Am, 2006, 88(Suppl 2): 83-87.

[8] Zhou GQ, Yang F, Leung VL, et al. Molecular and cellular biology of the intervertebral disc and the use of animal models [J]. Orthop Trauma, 2008, 22(4): 267-273.

[9] Masuda K, Imai Y, Okuma M， et al. Osteogenic protein-1 injection into a degenerated disc induces the restoration of disc height and structural changes in the rabbit anular puncture model [J]. Spine (Phila Pa 1976), 2006, 31(7): 34-54.

[10]王 鋒, 小 濤, 運 濤, 等. 單純Ⅱ型膠原酶消化法分離、培養人退變椎間盤髓核細胞的形態學觀察[J]. 中國脊柱脊髓雜志, 2010, 20(4): 300-304.

[11]唐 勇, 陽普山, 吳劍宏, 等. 人髓核間充質干細胞的分離提純方式及生物學活性鑒定[J]. 中國脊柱脊髓雜志， 2015, 25(6):533-540.

[12]Baptista LS, do Amaral RJ, Carias RB, et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples[J]. Cytotherapy, 2009, 11(6):706-715.

[13]胡文龍, 吳平平, 耿書國, 等. 人臍帶間充質干細胞分泌白細胞介素6促進骨肉瘤細胞增殖和遷移[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(2):201-207.

[14]龐榮清, 何 潔, 李福兵, 等. 一種簡單的人臍帶間充質干細胞分離培養方法[J]. 2011, 1(2):162-167.

[15]Ishige I, Nagamura-Inoue T, Honda MJ, et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord[J]. Int J Hematol, 2009, 90(2):261-269.

[16]Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science, 1999, 284(5411):143-147.

[17]Campagnoli C, Roberts IA, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-tri-mester fetal blood, liver and bone marrow[J]. Blood, 2001, 98(8):2396-2402.

[18]Blanco JF, Graciani IF， Sanchez-Guijo FM, et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human degenerated nucleus pulposus: comparison with bone marrow mesenchymal stromal cells from the same subjects[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2010, 35(26):2259-2265.

[19]陽普山, 劉子雙一, 陶暉, 等. 正常與退變髓核的髓核間充質干細胞代謝活性及干性基因表達的比較[J]. 中國脊柱脊髓雜志, 2014, 24(5):454-461.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Isolation and identification of nucleus pulposus mesenchymal stem cells from tissues removed by percutaneous endoscopic lumbar discectomy

SHANG Yu-pan2, WU Hao1, ZENG Xiao-li2, CHEANG Lek-hang4, YU Jun2, XIAO Qian-long2, TU Mei3, ZHANG Jia-qing2△

(1DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospital，2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofBasicMedicine，3DepartmentofBiologicalMaterial,CollegeofScienceandEngineering，JinanUniversity,Guangzhou510632,China;4CentroHospitalarCondedeS?oJanuário,MacauMedicalScience&TechnologyResearchAssociation，Macau999078,China.E-mail:zhangjiaqing@jnu.edu.cn)

AIM: To explore a novel method to isolate human nucleus pulposus mesenchymal stem cells (hNP-MSCs)invitroand to identify their biological characteristics. METHODS: The explant culture method was employed to isolate hNP-MSCs from nucleus pulposus tissue obtained by percutaneous endoscopic lumbar discectomy (PELD). The isolated cells were passaged for purification and culturedinvitrofollowed by morphological observation. The cell proliferation ability was detected by CCK-8 assay. Growth curves of the cells were drawn and surface antigens were detected by flow cytometry. The cells at the 3rd～6th passages were induced for adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation, and examined by oil red O staining, alizarin red staining and Alcian blue staining. RESULTS: The cells with self-renewal were obtained from nucleus pulposus tissue obtained by PELD. The results of flow cytometry analysis revealed that the cells were positive for CD29, CD44, CD90, CD73 and CD105, but negative for CD34 and CD45. The proliferative capacity was consistent with the growth characteristics of MSCs and multilineage differentiation potential was identified. CONCLUSION: A novel method to efficiently isolate and culture hNP-MSCs， PELD combined with explant culture method， was established, which would promote the study of regenerative medicine based on hNP-MSCs.

Percutaneous endoscopic lumbar discectomy; Explant culture method; Human nucleus pulposus mesenchymal stem cells

1000- 4718(2017)06- 1147- 06

2016- 11- 15

2017- 03- 28

中央高校基本科研基金(No. 21615436)；廣東科技項目基金(No. 2016B090913004)；廣東科技項目基金(No. 201508020035)；暨南大學附屬第一醫院科研培育專業基金項目(No. 511005024)

R616.5； R361

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.032

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 020-85220256; E-mail: zhangjiaqing@jnu.edu.cn