杏仁核腦區硫化氫對創傷后應激障礙模型大鼠抑郁樣行為的影響*

劉紅霞， 潘 虹， 王 華， 蔣淑君， 曹 璋， 辛文妤

(濱州醫學院 1基礎醫學院生理學教研室， 2病理學教研室， 3藥理學教研室， 山東 煙臺 264003)

杏仁核腦區硫化氫對創傷后應激障礙模型大鼠抑郁樣行為的影響*

劉紅霞1△， 潘 虹1， 王 華1， 蔣淑君1， 曹 璋2， 辛文妤3

(濱州醫學院1基礎醫學院生理學教研室，2病理學教研室，3藥理學教研室， 山東 煙臺 264003)

目的： 探討創傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)大鼠抑郁樣行為改變及杏仁核內胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)/硫化氫(hydrogen sulfide,H2S) 水平的變化，并研究補充H2S對大鼠抑郁樣行為的作用及機制。方法: 應用連續單一應激方案制備PTSD動物模型，用強迫游泳實驗和糖水偏好實驗檢測大鼠抑郁樣行為，用Western blot技術和亞甲基藍法檢測杏仁核CBS/H2S 體系含量，用整體細胞外電生理方法記錄杏仁核神經元放電情況。結果: 與正常對照組比較，PTSD組大鼠強迫游泳不動時間顯著延長(P<0.01)，糖水偏好率顯著降低(P<0.01)；杏仁核腦區的CBS/H2S 體系含量顯著降低(P<0.01)。與PTSD組比較，PTSD+硫氫化鈉組大鼠強迫游泳不動時間顯著減少(P<0.01)，糖水偏好率顯著升高(P<0.01)。微量壓力注射L-半胱氨酸使杏仁核神經元自發放電頻率顯著升高(P<0.01)。結論: PTSD大鼠通過抑制杏仁核CBS/H2S 體系導致抑郁樣行為加重。H2S拮抗PTSD大鼠抑郁樣行為的機制可能與其增加杏仁核神經元放電頻率和興奮性有關。

硫化氫； 創傷后應激障礙； 胱硫醚β-合成酶； 杏仁核

暴力事件、自然災害和重大交通事故等意外事件可導致親身經歷者和目擊者罹患創傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)，防治本病已成為全球普遍關注的醫學和社會問題。PTSD發病機制多樣，杏仁核可能是影響PTSD癥狀的關鍵核團，在條件性恐懼的獲得、表達和消退中具有關鍵作用[1]；人類腦成像研究表明PTSD患者杏仁核活動增強[2]，可能是PTSD患者條件性恐懼不易消退的原因；海馬-杏仁核特別是杏仁核基底外側核(basolate-ral amygdala，BLA)神經環路突觸效能的長時程增強(long-term potentiation，LTP)可能是條件性恐懼和應激所致焦慮的神經基礎[3]。目前沒有特效藥治療該病，主要有抗抑郁藥和心理治療，因此探究PTSD的神經生物學機制尋找治療靶點具有重要意義。腦內硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)有多種神經調控功能，可參與學習記憶和情緒調節。H2S選擇性上調含NR2B亞基的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受體功能，參與杏仁核介導的條件恐懼情感記憶行為；外源性H2S增強杏仁核依賴的情感記憶，減緩記憶的遺忘[4]。而PTSD患者的臨床癥狀中就有條件性恐懼行為和學習記憶能力下降。那么硫化氫是否影響PTSD患者的抑郁樣行為？其機制如何？我們應用連續單一應激方案制備PTSD大鼠模型，用強迫游泳實驗和糖水偏好實驗檢測大鼠抑郁樣行為，用Western blot技術和亞甲基藍法檢測杏仁核的胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)/H2S體系含量，用整體細胞外電生理方法記錄杏仁核神經元放電情況，對以上問題進行研究。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及給藥

成年健康雄性Wistar大鼠，體質量200～300 g，青島市藥檢所動物中心提供，大鼠實驗前適應實驗室環境1周。造模后第14天檢測行為學指標。治療組于造模前0.5 h及行為學測試前0.5 h分別腹腔注射11.2 mg/kg 硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS)。正常對照組(normal組)和PTSD組腹腔注射等劑量生理鹽水。

2 主要藥品和儀器

CBS抗體購自Santa Cruz; NaHS和滂胺天藍購自Sigma; Micro1401數據采集系統和Spike2數據分析系統購自CED。

3 主要方法

3.1 制備PTSD模型 采用連續單一應激(single prolonged stress，SPS)方案制備大鼠PTSD模型，將大鼠連續進行下述處理：禁錮2 h；強迫性游泳20 min(水溫25 ℃，水深40 cm)；休息15 min后乙醚麻醉，意識喪失后停止麻醉。

3.2 大鼠強迫游泳實驗 將單只大鼠置于游泳圓筒內(筒高70 cm, 內徑30 cm, 水面高度35 cm, 水溫23～25 ℃)，游泳6 min，前2 min作為大鼠適應階段，后4 min記錄不動狀態的時間。每只大鼠更換1次游泳用水，避免重復用水對測試大鼠產生影響。用漂浮不動時間作為判斷大鼠抑郁嚴重程度的指標，不動時間越長，表示大鼠絕望狀態越嚴重，抑郁樣行為越嚴重。

3.3 大鼠糖水偏好實驗 訓練期間，大鼠單籠飼養，每籠配備2瓶水，1瓶飲用水，1瓶1%蔗糖水溶液，適應該狀態48 h，每12 h對調2個水瓶位置，用以消除大鼠的飲水位置偏好。測試前禁食禁水12 h開始，將飲用水、1%蔗糖水溶液放回原位，讓大鼠自由飲水1 h，分別計算出各水瓶消耗量。計算糖水偏好率(%)：蔗糖水飲用體積/總飲用體積×100%。糖水偏好率值越低，表示大鼠快感缺失，具有抑郁傾向。

3.4 硫化氫含量檢測 腦組織的H2S含量用亞甲藍法進行檢測[5]。大鼠麻醉后斷頭，冰上取雙側杏仁核，稱重-80 ℃冰箱備用。在冷的磷酸氫鉀緩沖液(pH 7.4)中將腦組織勻漿裂解(每mg組織加10 μL 緩沖液)。200 μL 組織裂解上清與1% 醋酸鋅生成硫化鋅沉淀，20 000×g離心力離心15 min，將沉淀用溶于7.2 mol/L鹽酸的N,N-二甲基對苯二胺硫酸鹽(20 mmol/L)150 μL 和溶于1.2 mol/L鹽酸的FeCl3(30 mmol/L)100 μL 液體進行溶解。靜置15 min，將200 μL轉移到96孔板中用670 nm 波長行吸光度檢測。配制NaHS濃度標準曲線和吸光度(A)值，計算樣品H2S含量。為防止H2S與玻璃結合，整個實驗采用聚丙烯塑料管為容器。

3.5 Western blot方法檢測腦組織CBS蛋白的表達 大鼠麻醉后斷頭，冰上取出雙側杏仁核，稱重后-80 ℃冰箱備用。提取組織總蛋白并BCA法行蛋白定量，加入上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min，凍存于-80 ℃冰箱備用。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，各泳道加入的樣品蛋白總量為40 μg。電泳將蛋白分離，濕轉法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移至PVDF膜上。TBST配制的5%脫脂奶粉室溫振搖1 h，加 I 抗 (CBS多克隆抗體，1∶2 000)4 ℃過夜，HRP標記的山羊抗兔IgG II 抗(1∶2 000)室溫2 h，并分別洗滌，ECL顯色后暗室中壓片、顯影、定影，掃描后用 ImageJ軟件分析各條帶的灰度值。

3.6 電生理學方法 體質量200～300 g的健康雄性Wistar大鼠，腹腔注射20%烏來糖(1 g/kg)進行麻醉。大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，參照大鼠腦圖譜(Paxinos & Watson， 2005)定位，BLA區坐標如下：前囟向后2.8 mm，中線旁開4.5 mm，向下7.5～9.0 mm。液壓推進器將三管玻璃微電極送至杏仁核，觀察細胞放電平穩5 min，用PM2000B型四道壓力注射儀通過氣體壓力(1 500 ms, 5.0～15.0 psi)將藥物注射到神經元表面，用Spike2數據分析系統對細胞放電頻率進行分析，通過Micro1401數據采集系統顯示細胞放電曲線。將加藥后反應高峰50 s內平均每秒放電頻率作為藥物的效應，以加藥前120 s內平均每秒放電頻率為對照。

4 統計學處理

用SPSS 18.0軟件進行統計分析。作圖采用SigmaPlot 10.0。計量數據采用均數±標準誤(mean±SEM)表示，采用t檢驗或單因素方差分析(兩兩比較行Bonferroni校正的t檢驗)分析不同組間的差別，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 SPS方案制備PTSD動物模型后，大鼠抑郁樣行為加重，杏仁核CBS/H2S體系生成減少

采用強迫游泳實驗檢測大鼠抑郁行為，結果如圖1所示，與正常對照組比較，PTSD組大鼠強迫游泳不動時間顯著延長(P<0.01)。

Figure 1.The immobility time of forced swimming test in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

圖1 造模前后大鼠強迫游泳實驗中不動時間的比較

采用糖水偏好實驗檢測大鼠抑郁行為，結果如圖2所示，與正常對照組比較，PTSD組大鼠糖水偏好率顯著降低(P<0.01)。

如圖3所示，與正常對照組相比，PTSD大鼠杏仁核腦區的H2S含量顯著降低(P<0.01)。

如圖4所示，PTSD大鼠海馬腦區CBS的表達水平明顯下降(P<0.05)。

2 H2S供體NaHS可改善PTSD大鼠抑郁樣行為

與PTSD組比較，PTSD+NaHS組大鼠強迫游泳不動時間顯著減少(P<0.01)，見圖5A。與PTSD組比較，PTSD+NaHS組大鼠糖水偏好率顯著增加(P<0.01)，見圖5B。強迫游泳實驗及糖水偏好實驗結果提示H2S改善PTSD大鼠抑郁樣行為。

Figure 2.The sucrose preference in sucrose preference test in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

圖2 造模前后大鼠糖水偏好實驗中糖水偏好率的比較

Figure 3.The H2S level in the amygdala tissues of normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

圖3 造模前后大鼠杏仁核組織內源性H2S含量比較

Figure 4.The CBS level in the amygdala tissues in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=4.##P<0.01vsnormal group.

圖4 造模前后大鼠杏仁核組織CBS含量的比較

Figure 5.The immobility time in forced swimming test (A) and the sucrose preference in sucrose preference test (B) in different groups. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group；**P<0.01vsPTSD group.

圖5 各組大鼠強迫游泳不動時間和糖水偏好實驗中糖水偏好率的比較

3 H2S供體L-cysteine對正常大鼠杏仁核神經元細胞外放電的影響

用多管微電極細胞外電生理記錄方法觀察L-cysteine對大鼠整體狀態下杏仁核神經元放電頻率的影響，結果如圖6所示。微量壓力注射無菌生理鹽水前后杏仁核神經元的放電頻率差別無統計學顯著性；注射L-cysteine后杏仁核神經元自發放電頻率顯著升高(P<0.01)。

Figure 6.The effects of H2S system on the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons. A: initial graph of the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons; B: the quantitative analysis of saline on firing rate； C: the quantitative analysis of L-cysteine on firing rate. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsbefore.

圖6 L-cysteine對正常大鼠杏仁核神經元放電頻率的影響

討 論

PTSD是個體經歷威脅性或災難性心理創傷后，精神癥狀延遲出現和長期存在的精神障礙，患者有強烈的恐懼和驚嚇反應。本研究選取的SPS動物模型是PTSD行為敏感化常用的應激模式，能夠模仿人類嚴重創傷事件后長期的生理改變和行為改變等關鍵特征，主要模擬了PTSD患者對創傷線索的驚嚇反應增強。強迫游泳實驗和糖水偏好實驗可作為動物抑郁程度的客觀評價指標。本研究采用SPS方案制備PTSD動物模型，采用強迫游泳實驗中不動時間和糖水偏好實驗來檢測大鼠抑郁樣行為。實驗結果顯示，與正常對照組比較，PTSD組大鼠強迫游泳實驗中不動時間顯著延長，糖水偏好實驗中糖水偏好率顯著降低，提示PTSD模型大鼠表現出抑郁樣行為，這與陳云春等[6]研究結果一致，提示SPS方案制備的PTSD動物模型可成功模仿人類的抑郁狀態。

杏仁核的主要功能是產生與外界信息相適應的情緒行為，調控情緒學習和記憶[7]。其中杏仁核基底外側復核和中央核被認為是恐懼學習和記憶中重要的中樞。杏仁核功能失調可導致患者或動物出現異常的情感行為和情感功能障礙[8]。PTSD患者和動物的研究表明杏仁核、海馬與內側前額葉皮層在PTSD相關癥狀中具有重要作用；杏仁核可能是影響PTSD癥狀的關鍵核團，在條件性恐懼的獲得、表達和消退中具有關鍵作用[1]；人類腦成像研究表明PTSD患者的杏仁核活動增強[2]，這可能是PTSD患者條件性恐懼不易消退的原因。故我們研究了PTSD模型大鼠與杏仁核相關的行為學變化和機制。

氣體信號分子H2S在腦內含量較高(50～160 μmol/L)，對缺氧誘導的皮層神經元損傷有保護作用[9]，硫化氫參與學習記憶和情緒調節。研究證實H2S選擇性上調含NR2B亞基的NMDA受體的功能進而調節杏仁核介導的條件恐懼情感記憶行為，外源性H2S可增強杏仁核依賴的情感記憶，并減緩記憶的遺忘[4]。CBS是大腦合成H2S的關鍵酶，免疫組化結果顯示杏仁核表達大量的CBS，主要表達于星形膠質細胞[10]。杏仁核內注射CBS抑制劑可損傷大鼠線索型恐懼記憶，表明膠質細胞源性H2S是杏仁核相關情感記憶所必需的。我們的實驗結果顯示PTSD大鼠杏仁核腦區CBS的表達和H2S的生成均顯著低于正常對照組，提示杏仁核腦區CBS/H2S體系受抑制可能與PTSD患者的抑郁樣行為相關。侯曉怡[11]報道了外源性補充H2S對急、慢性應激導致的大鼠抑郁樣行為均有改善作用。NaHS是較常用H2S供體，腹腔注射NaHS可以促進腦內H2S水平的升高[5]。故本研究通過腹腔注射NaHS研究H2S對PTSD大鼠抑郁樣行為的影響。實驗結果顯示NaHS治療明顯改善了PTSD大鼠的抑郁樣行為。這些結果均提示調控腦內H2S含量可能是治療不同病因誘發抑郁癥的新策略。

杏仁核區α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid, AMPA)受體和NMDA受體等興奮性谷氨酸受體在情感學習和記憶形成過程中扮演著重要角色[12]；H2S可抑制興奮性氨基酸的釋放，易化海馬LTP[13]；電生理研究也證實了H2S選擇性上調含NR2B亞基的NMDA受體的功能進而參與杏仁核介導的條件恐懼情感記憶行為，外源性H2S可增強杏仁核依賴的情感記憶，并減緩記憶的遺忘[4]。以上研究均提示硫化氫可以影響神經元的電生理特性。故本實驗利用在體細胞外電生理記錄法，觀察H2S供體L-cysteine對大鼠杏仁核神經元電生理特性的影響。與以上文獻[4, 9]報道一致，L-cysteine可以影響神經元的電生理特性，主要表現為L-cysteine對杏仁核神經元產生興奮效應，使杏仁核神經元放電頻率升高。綜合文獻及實驗結果我們分析，增加杏仁核神經元放電頻率和興奮性可能是H2S改善PTSD大鼠抑郁樣行為的機制之一。

綜上所述，PTSD大鼠通過抑制杏仁核腦區CBS/H2S 體系導致抑郁樣行為加重，H2S可拮抗PTSD大鼠抑郁樣行為，該作用可能與其增加杏仁核神經元放電頻率和興奮性有關。該研究可為臨床尋找防治創傷后應激障礙靶點提供新思路和實驗依據。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of amygdala H2S system on depression-like behavior in posttraumatic stress disorder rats

LIU Hong-xia1, PAN Hong1, WANG Hua1, JIANG Shun-jun1, CAO Zhang2, XIN Wen-yu3

(1DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,2DepartmentofPathology,3DepartmentofPharmacology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China.E-mail:liuhongxia3210@163.com)

AIM: To explore the depression-like behavior and cystathionine β-synthase (CBS)/hydrogen sulfide (H2S) levels of amygdala in posttraumatic stress disorder (PTSD) rats and to study the effect of exogenous H2S on PTSD rats.METHODS: Single prolonged stress paradigm was adopted to prepare PTSD animal model. Forced swimming test and sucrose preference test were used to evaluate the depression-like behavior. The content of CBS/H2S in amygdala tissue was measured by Western blot and methylene blue method.Invivoextracellular single unit recordings was used to examine the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons. RESULTS: The immobility time in forced swimming test of PTSD group increased and sucrose preference in sucrose preference test of PTSD group decreased compare with normal group (P<0.01). CBS/H2S level in amygdala tissue of PTSD group decreased compared with normal group (P<0.01). The immobility time of the rats in forced swimming test of NaHS+PTSD group decreased and the sucrose prefe-rence in sucrose preference test of NaHS+PTSD group increased compare with PTSD group (P<0.01). L-cysteine increased the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons (P<0.01). CONCLUSION: Depression-like behavior is aggravated in PTSD model rats owing to the inhibition of CBS/H2S content in amygdala tissue. The mechanism of behavior-improving effect of H2S on PTSD model rats is possibly related to excitating amygdala neurons and increasing the frequency of spontaneous discharges.

Hydrogen sulfide; Posttraumatic stress disorder; Cystathionine β-synthase; Amygdala

1000- 4718(2017)06- 0988- 05

2016- 10- 19

2017- 03- 20

山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2013HL009； No.BS2015YY036； No.BS2014YY049)；煙臺市科技發展計劃項目(No.2012ZH248； No.2015ZH085)

R749.5+; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.005

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