白皮杉醇抑制前列腺癌細胞株增殖、遷移與侵襲*

李章春 ， 李 珀， 鄧超男， 羅 恒

(1黔南民族醫學高等專科學?；A醫學部，貴州 都勻 558000； 2貴州醫科大學附屬醫院病理科，貴州 貴陽 550004；3貴陽市第一人民醫院泌尿外科，貴州 貴陽 550003)

白皮杉醇抑制前列腺癌細胞株增殖、遷移與侵襲*

李章春1△， 李 珀2， 鄧超男2， 羅 恒3

(1黔南民族醫學高等專科學?；A醫學部，貴州 都勻 558000；2貴州醫科大學附屬醫院病理科，貴州 貴陽 550004；3貴陽市第一人民醫院泌尿外科，貴州 貴陽 550003)

目的： 觀察白皮杉醇對前列腺癌細胞株DU145的細胞活力、遷移與侵襲能力的作用并初步討論其機制。方法: CCK-8法檢測不同濃度白皮杉醇(0、5、10、20、40和80 μmol/L)作用不同時間(12、24、36和48 h)對DU145細胞活力的影響；劃痕實驗與Transwell小室法分別檢測白皮杉醇對DU145細胞遷移與侵襲能力的影響；Western blot法檢測p-JAK2與p-STAT3的蛋白水平。結果: CCK-8法結果顯示白皮杉醇呈濃度依賴性抑制DU145細胞的活力；給予白皮杉醇干預后，細胞遷移數和侵襲數顯著減少，p-JAK2與p-STAT3蛋白水平顯著下降。結論: 白皮杉醇呈濃度依賴性抑制前列腺癌細胞的生長，并具有抑制細胞遷移與侵襲的作用，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關。

白皮杉醇； 細胞活力； 細胞遷移； JAK2/STAT3信號通路

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是老年男性常見的一種惡性腫瘤，在全球各種癌癥的死亡率中位居第二[1]。我國的前列腺癌發病率低于西方發達國家，但隨著生活水平的提高以及飲食結構的改變，老齡化人口的逐漸增多，前列腺癌的發病率呈逐漸上升的趨勢，嚴重地影響我國老年男性健康[2]。前列腺癌的發病機制至今尚未清晰，大多數患者確診時已處于腫瘤中晚期，并出現骨轉移，導致患者預后不良[3]。

白皮杉醇(piceatannal，PIC)主要存在于葡萄、大黃和甘蔗中，不穩定，易氧化[4]。研究表明其分子結構中存在2個苯環和多個羥基，它們與白皮杉醇的抗氧化與清除氧自由基作用相關。多項研究發現白皮杉醇能夠抑制促使腫瘤細胞發生發展的酶，如環氧化酶、過氧化氫酶、細胞色素P450和核苷酸還原酶等，進而干擾腫瘤細胞的生長，從而發揮抗腫瘤的作用[5]。此外，白皮杉醇具有抗氧化作用，減緩過量活性氧和自由基對DNA的損傷，降低癌癥的發生率[6]。本文擬研究白皮杉醇對前列腺癌細胞株DU145的活力、遷移和侵襲能力的作用，并探討其初步的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人前列腺癌DU145細胞株購自上海中科院細胞庫；白皮杉醇購自成都德思特生物技術有限公司；青霉素和鏈霉素購自華北制藥集團公司；胰蛋白酶購自Sigma；CCK-8試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；抗p-JAK2與p-STAT3抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 細胞的培養、傳代 將DU145細胞加入含有10%胎牛血清，青霉素與鏈霉素各1×105U/L的RPMI-1640培養液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，2～3 d 更換培養基1次。實驗取對數生長期細胞。細胞傳代：待細胞融合至80%～90%，0.25%胰蛋白酶消化，吹打至細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用培養基重懸，置于恒溫培養箱中培養，6 h后換液。

2.2 CCK-8法檢測DU145細胞的活力 取在對數生長期的細胞懸液按每孔3×103個接種于96孔板，待細胞貼壁后，分別加入白皮杉醇使最終濃度分別為0、5、10、20、40和80 μmol/L，分別繼續培養12、24、36和48 h，棄去上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養4 h，用酶聯儀于450 nm處測量吸光度(A)。

2.3 實驗分組 空白對照組(control)，不給藥處理；溶劑對照組(vehicle)，加入同等劑量的甲醇溶劑；藥物組(PIC組)，加入40 μmol/L的白皮杉醇；各組進行相應處理后繼續培養36 h，進行后續實驗。

2.4 劃痕實驗 收集各組細胞，以2×108/L接種于48孔板中，待細胞融合到80%～90%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕，PBS洗滌3次，加入無血清培養基，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養24 h后，觀察細胞遷移軌跡，記錄數據，計數。

2.5 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 將4 ℃預冷的無血清培養基稀釋Matrigel，使終濃度為1 g/L，于小室底部中央垂直加入100 μL稀釋后的Matrigel，37 ℃溫育使成膠狀。將處于對數生長期的各組細胞，計數后調整細胞濃度為5×108/L，于Transwell小室的上室中加入100 μL細胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液。在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，PBS洗2次，10%甲醛固定15 min，結晶紫染色30 min，于倒置顯微鏡下觀察計數。

2.6 Western blot實驗 收集各組細胞，用RIPA細胞裂解液裂解，提取總蛋白后采用BCA法定量，調整蛋白濃度。取適量裂解產物，上樣后進行SDS-PAGE，電轉至硝酸纖維素膜，加入5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，孵育相應 I 抗[p-JAK2(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、JAK2(1∶4 000)、STAT3(1∶4 000)和GAPDH(1∶4 000)]，4 ℃孵育過夜，洗膜后，室溫孵育相應 II 抗1 h，洗膜，使用化學發光法試劑盒對PVDF膜進行曝光顯影，成像掃描分析系統測定目的和內參照條帶的吸光度。

3 統計學處理

所有數據采用SPSS 15.0統計軟件進行分析，實驗結果以均數±標準差(mean±SD)表示，多組定量數據兩兩比較，符合方差齊性要求,各組間均數比較時采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 白皮杉醇對DU145細胞活力的影響

結果顯示，給予藥物干預的細胞存活率顯著下降，并隨時間延長而存活率降低，至36 h降到最低值，36 h與48 h的相對存活率無顯著差異。如圖1所示，36 h時20 μmol/L與40 μmol/L白皮杉醇對細胞的活力抑制率分別是(56.36±3.2)%與(44.54±3.2)%，為了得到較好的實驗結果，我們選取40 μmol/L白皮杉醇培養細胞36 h進行后續實驗。

Figure 1.The effect on the survival rate of DU145 cells by piceatannol. Mean±SD.n=6.

圖1 白皮杉醇對DU145細胞相對存活率的影響

2 白皮杉醇對DU145細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示給予藥物干預的DU145細胞的遷移能力顯著低于空白對照組(P<0.05)，空白對照組與溶劑組間無顯著差異，見圖2。

Figure 2.The effect of piceatannol on the migration of DU145 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 白皮杉醇對DU145細胞遷移能力的影響

3 白皮杉醇對DU145細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示，與空白對照組相比，藥物組發生侵襲的細胞數顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，空白對照組和溶劑組侵襲的細胞數之間的差異無統計學顯著性，見圖3。

Figure 3.The effect of piceatannol on the invasion of DU145 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 白皮杉醇對DU145細胞侵襲能力的影響

4 白皮杉醇對p-JAK2與p-STAT3蛋白表達水平的影響

Western blot實驗結果顯示藥物組細胞中的p-JAK2與p-STAT3蛋白水平顯著低于空白對照組(P<0.05)，空白對照組和溶劑組間差異無統計學顯著性。t-JAK2、t-STAT3的蛋白變化水平的差異無統計學顯著性，見圖4。

Figure 4.The effect of piceatannol on the protein expression of p-JAK2 and p-STAT3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 白皮杉醇對p-JAK2與p-STAT3蛋白表達水平的影響

討 論

白皮杉醇是白藜蘆醇的羥基化類似物，二者具有相似的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌和清除自由基等[7]。研究發現白皮杉醇可以抑制腫瘤細胞DNA的合成，誘導細胞周期中G1期縮短，降低CDK2和CDK4的含量，并在24 h內抑制CDK2和CDK4的活性[8]。我們研究發現白皮杉醇抑制前列腺癌細胞的存活率，與藥物濃度和時間具有依賴性。此外，實驗表明白皮杉醇具有抑制前列腺癌細胞遷移數和侵襲數的作用，提示白皮杉醇可能對前列腺癌細胞株的增殖、遷移和侵襲具有抑制作用。

STAT家族是體內一類重要的轉錄因子，對多種信號的轉導具有非常關鍵的作用，其中STAT3與腫瘤的發生發展關系密切，在多種腫瘤中發現STAT3的異常表達與活化，具有促進腫瘤發生發展的作用[9]。研究發現干擾STAT3表達后，胰腺癌細胞株SW1990體外侵襲力和動物體內轉移能力均減弱[10]。JAK家族蛋白包括JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2四個結構功能相似的蛋白。通常，STAT3以非磷酸化的形式存在于胞漿中，當細胞受到刺激后，STAT3磷酸化后被激活，進入細胞核，通過與靶基因相應的堿基對序列結合，調節基因轉錄[11-12]。已有報道指出姜黃素的結構類似物通過抑制JAK2/STAT3信號通路，進而促進了人腎癌細胞和黑色素細胞的凋亡[13]；另外通過抑制JAK2/STAT3信號通路，抑制乳腺癌細胞周期并抑制腫瘤的生長與轉移[14]。我們實驗發現給予白皮杉醇干預后，JAK2與STAT3的磷酸化水平均顯著下降，提示白皮杉醇可能通過抑制JAK2與STAT3的磷酸化，從而抑制相應癌基因的表達，進而抑制前列腺細胞的活力、遷移與侵襲。

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(責任編輯： 林白霜, 羅 森)

Piceatannol inhibits prostate cancer cell proliferation, migration and invasion

LI Zhang-chun1， LI Po2， DENG Chao-nan2， LUO Heng3

(1SchoolofBasicMedicalSciences,QiannanMedicalCollegeforNationalities,Duyun558000,China;2DepartmentofPathology,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China;3DepartmentofUrinarySurgery,GuiyangFirstPeople’sHospital,Guiyang550003,China.E-mail:medlizhangchun@163.com)

AIM: To investigate the effect of piceatannol on the viability, and the abilities of migration and invasion in the prostate cancer cells.METHODS: DU145 cells were treated with piceatannol at different doses (0, 5, 10, 20, 40 and 80 μmol/L) for different time (12, 24, 36 and 48 h) as indicated. The cell viability was assessed by CCK-8 assay. The migration and invasion abilities of the cells were analyzed by wound healing assay and Transwell assay, respectively. The protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 were detected by Western blot.RESULTS: Piceatannol dose-dependently decreased the cell viability. After treatment with piceatannol, the abilities of migration and invasion of the cells were significantly inhibited. Moreover, treatment with piceatannol resulted in marked decreases in the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3. CONCLUSION: Piceatannol inhibits the viability, migration and invasion of the prostate cancer cells via regulating the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Piceatannol; Cell viability; Cell migration; JAK2/STAT3 signaling pathway

1000- 4718(2017)06- 1130- 04

2016- 11- 16

2017- 02- 22

貴州省衛生廳科學技術基金項目(No. gzwkj2010-1-068)

R730.23； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.028

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