咯利普蘭通過 NF-κB抑制MRP8/14在RAW264.7細胞中促炎性因子的釋放*

楊 晨， 王 俊， 黃 林， 羅海華， 姜 勇， 劉愛華△

(南方醫科大學 1南方醫院呼吸內科， 2病理生理學教研室和廣東省蛋白質組學重點實驗室， 廣東 廣州 510515)

咯利普蘭通過 NF-κB抑制MRP8/14在RAW264.7細胞中促炎性因子的釋放*

楊 晨1， 王 俊1， 黃 林1， 羅海華2， 姜 勇2， 劉愛華1△

(南方醫科大學1南方醫院呼吸內科，2病理生理學教研室和廣東省蛋白質組學重點實驗室， 廣東 廣州 510515)

目的： 探討PDE4抑制劑咯利普蘭抑制髓樣相關蛋白8/14(MRP8/14)對小鼠巨噬細胞系RAW264.7中促炎性因子釋放的刺激作用，并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法: MRP8/14刺激RAW264.7細胞，采用液相芯片技術和實時熒光定量PCR (qPCR)技術分別檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)的蛋白和mRNA水平；咯利普蘭預處理RAW264.7細胞后，MRP8/14刺激細胞，采用液相芯片技術和qPCR技術分別檢測TNF-α和IL-6的蛋白水平和mRNA水平；Western blot法檢測NF-κB P65蛋白磷酸化水平；間接免疫熒光法檢測RAW264.7細胞內NF-κB P65蛋白核移位情況。結果: 液相芯片及qPCR結果顯示MRP8/14具有很強的促炎性因子TNF-α和IL-6釋放的作用(P<0.01)，而咯利普蘭可以顯著減弱MRP8/14促炎性因子釋放的作用(P<0.05)。此外，MRP8/14能夠誘導NF-κB P65蛋白發生磷酸化，胞核中P65蛋白增加；而咯利普蘭顯著減弱NF-κB P65蛋白磷酸化(P<0.05)。結論: 咯利普蘭可能通過NF-κB途徑顯著減弱MRP8/14的促炎作用。

急性肺損傷； 咯利普蘭； 髓樣相關蛋白8/14； 炎性因子； 核因子κB

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由多種炎癥介質和細胞因子介導的、以彌漫性肺泡壁毛細血管通透性增加為特征的炎癥損傷性疾病，臨床多表現為急性、進行性、缺氧性呼吸衰竭,是臨床常見的危重癥之一[1]。

髓樣相關蛋白8(myeloid-related protein 8， MRP8；又稱S100A8蛋白)與MRP14蛋白(S100A9蛋白)屬于鈣結合蛋白S100蛋白家族的成員，兩者常以鈣離子依賴性的方式形成異源二聚體MRP8/14[2]。研究發現，MRP8/14作為新的炎性組分可以激活巨噬細胞，通過核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)途徑轉錄合成腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性因子，TNF-α的激活又可促進巨噬細胞合成分泌白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8等大量相關炎性因子，從而產生炎性因子的放大效應，可誘發、加重肺損傷[3]。

磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)4能特異性地水解環磷腺苷[4]。研究發現，選擇性PDE4抑制劑咯利普蘭(rolipram)能抑制中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的炎性趨化，抑制單核巨噬細胞、氣道上皮細胞等釋放趨化因子、炎性因子以及黏附分子等，起到抑制炎癥的作用[5]。

本研究旨在探討咯利普蘭是否可以通過NF-κB抑制MRP8/14的促炎性因子TNF-α、IL-6等釋放作用及炎癥放大效應，減輕肺損傷，為急性肺損傷的診療提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 細胞培養

小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7由本實驗室保存，采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2條件下進行培養，待細胞生長至80% 融合度時進行傳代。

2 主要試劑

含His標簽的鼠MRP8及MRP14原核表達載體pET-14b/MRP8和pET-14b/MRP14由本實驗室構建并保存；Trizol總RNA提取試劑、LB培養基購自Invitrogen；DMEM培養基和胎牛血清購Gibco；RT Profiler PCR Array Kit 購自Qiagen；ReverTra Ace qPCR RT Kit購自TOYOBO；Fast Start Universal SYBR Green Master購自Roche；細胞因子檢測試劑盒購自EMD Millipore；磷酸化NF-κB P65及HRP標記的抗鼠IgG購自Cell Signaling Technology；lamin B1單克隆抗體購自Proteintech；P65特異性抗體購自Abcam；羊抗兔IgG-HRP和β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Alexa Fluor 488標記的驢抗兔IgG購自Molecular Probes；Super Signal West Pico化學發光底物購自Thermo；咯利普蘭購自Selleck；引物合成由華大基因公司完成；其它試劑均為進口分裝或國產分析純。

3 主要方法

3.1 MRP8/14蛋白制備 采用原核表達系統表達含His標簽的MRP8及MRP14蛋白，按照蛋白純化的標準步驟，經鎳離子親和層析柱純化，透析并過濾，然后用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定蛋白純度，使用BCA法進行蛋白定量后，制備所得蛋白單體按等摩爾數混合于制備液中[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，0.1%膽酸鈉， 1 mmol/L乙二胺四乙酸, 1 mmol/L β-巰基乙醇]，加入CaCl2使其在儲備液中終濃度為2 mmol/L，室溫孵育10 min后將制備得到的蛋白復合物于實驗前與多黏菌B(polymyxin B，PMB)10 mg/L 孵育30 min，以阻斷純化所得的蛋白中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的生物學活性，具體方法見參考文獻[6]。

3.2 MRP8/14刺激RAW264.7細胞后檢測培養上清炎性因子TNF-α和IL-6的水平 取對數生長期細胞，以5×105接種于24孔板中，分別設計0 h、3 h、6 h、12 h和24 h組，每組設計3個復孔，待細胞生長至融合度達80%按照實驗設計的時點加入1.5 mg/L的MRP8/14蛋白二聚體，刺激時點到后收集細胞培養上清，利用液相芯片技術(LiquiChip)檢測炎癥因子TNF-α和IL-6的水平。具體檢測方法按試劑盒操作說明進行。

3.3 MRP8/14刺激RAW264.7細胞后檢測炎性因子TNF-α和IL-6的mRNA表達水平 取對數生長期細胞，以1×106接種于6孔板中，分別設 0 h、3 h、6 h、12 h和24 h組，待細胞生長至融合度達80%時按照實驗設計的時點加入1.5 mg /L 的MRP8/14蛋白二聚體，刺激時間到后收集各組細胞，按照說明書提取總RNA，定量后將總RNA按TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。TNF-α、IL-6和β-actin擴增的上、下游引物見表1，然后利用ABI 7500系統進行定量分析。

表1 TNF-α、IL-6和β-actin的引物序列

Table 1.The primer sequences of TNF-α, IL-6 and β-actin for qPCR

NameForwardprimer(5’-3’)Reverseprimer(5’-3’)TNF-αCCGAACCCTCCACTCAGATGACAAGGTACAACCCATCIL-6CCACTTCACAAGAGGCTTAAGTGCATCATCGTTGTTACβ-actinGCGAGCACAGCTTCTTTGCGCGACGCGATATCGTCATC

3.4 咯利普蘭對MRP8/14刺激細胞后培養上清炎性因子TNF-α和IL-6水平的影響 取對數生長期細胞，以5×105接種于24孔板中，分別設計對照組、咯利普蘭組、MRP8/14組和咯利普蘭+MRP8/14組，每組設計3個復孔，待細胞生長至融合度達80%按照實驗設計預先加入10 μmol/L的咯利普蘭處理細胞1 h后，再加入1.5 mg/L的MRP8/14蛋白二聚體刺激3 h后收集細胞培養上清，利用液相芯片檢測炎癥因子TNF-α、IL-6的水平。具體檢測方法按試劑盒操作說明進行。

3.5 咯利普蘭對MRP8/14刺激RAW264.7細胞后炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA表達水平的影響 取對數生長期細胞，以1×106接種于6孔板中，分別設計對照組、咯利普蘭組、MRP8/14組和咯利普蘭+MRP8/14組，待細胞生長至融合度達80%時按照實驗設計預先加入10 μmol/L的咯利普蘭處理細胞1 h后，再加入1.5 mg/L 的MRP8/14蛋白二聚體刺激3 h后收集各組細胞，按照說明書提取總RNA，定量后將總RNA按TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。擴增后利用ABI 7500系統進行定量分析。

3.6 細胞核內NF-κB P65蛋白水平檢測 取對數生長期細胞，以2×106接種于10 cm皿，不同時點(0、30、60、120和240 min)加入1.5 mg/L的MRP8/14蛋白二聚體刺激細胞，收取細胞進行核質分離。具體方法如下：每皿加入2 mL勻漿緩沖液，收取細胞置于冰上孵育15 min，加入10 μL 10% NP40，混勻后，4 ℃ 800×g離心5 min，棄上清，勻漿緩沖液重懸洗滌沉淀3次，最后加入60 μL核提取緩沖液，冰上孵育1 h，4 ℃ 18 000×g離心25 min后取上清即為核蛋白。然后進行Western blot實驗， I 抗為NF-κB P65(1∶1 000)和lamin B1(1∶1 000)，室溫孵育4 h， II 抗分別為HRP標記的IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h，經Super Signal West Pico化學發光底物顯色，利用Kodak IS4000R圖像工作站進行化學發光檢測。圖片掃描后使用Gel-Pro軟件測量蛋白條帶的灰度值，以P65/lamin B1比值行半定量分析

3.7 間接免疫熒光標記檢測NF-κB P65的定位 1×104個細胞接種于Petri皿中，37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后給予MRP8/14(1.5 mg/L)刺激1 h，4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.2% Triton X-100室溫處理10 min，3%BSA封閉1 h，加入 I 抗(NF-κB P65，1∶100稀釋)孵育過夜，洗滌后加入 II 抗(Alexa Fluor 488標記的IgG，1∶100稀釋)避光孵育1 h，洗滌后加入DAPI (1∶200)避光孵育30 min，漂洗后使用Zeiss共聚焦顯微鏡觀察拍照。

3.8 細胞核內NF-κB P65蛋白水平檢測 取對數生長期細胞，以2×106接種于6孔板中，分別設計對照組、咯利普蘭組、MRP8/14組和咯利普蘭+MRP8/14組，待細胞生長至融合度達80%，加入10 μmol/L的咯利普蘭預刺激細胞1 h，然后加入1.5 mg/L的MRP8/14蛋白二聚體刺激細胞1 h后收取細胞進行蛋白提取，方法如下: 每孔加入100 μL細胞裂解液，收集細胞，將其置于冰上裂解30 min，然后4 ℃ 18 000×g離心25 min，吸取上清，上清即為總蛋白；將各組細胞總蛋白進行Western blot 實驗， I 抗為p-NF-κB P65(1∶1 000)和NF-κB P65(1∶1 000)，室溫孵育過夜，II 抗為HRP標記的IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h，其余步驟同3.6。

4 統計學處理

實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MRP8及MRP14蛋白純化鑒定

使用鎳離子親和層析柱純化MRP8及MRP14蛋白單體，SDS-PAGE進行鑒定分析，結果顯示純化的蛋白質分子大小與預期相同，純度>90%，見圖1。

Figure 1.Purification of MRP8 and MRP14 fusion proteins.

圖1 MRP8及MRP14蛋白的純化

2 MRP8/14刺激RAW264.7細胞后炎性因子TNF-α和IL-6表達水平的檢測

細胞因子測定結果顯示，與對照組相比，MRP8/14能夠促進炎性因子TNF-α和IL-6的大量產生。加入1.5 mg/L的MRP8/14后TNF-α在3 h達高峰并且一直維持在較高水平；IL-6在3 h顯著升高并維持遞增趨勢；qPCR結果也顯示了大致相同的趨勢，見圖2。

Figure 2.The effect of MRP8/14 on the releases of TNF-α and IL-6 in the RAW264.7 cells. A: the releases of TNF-α and IL-6 were quantified by LiquiChip; B: the mRNA expression of TNF-α and IL-6 was quantified by qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

圖2 MRP8/14對炎性因子TNF-α和IL-6釋放的影響

3 咯利普蘭對MRP8/14刺激細胞后炎性因子TNF-α和IL-6表達水平的影響

液相芯片技術和qPCR結果顯示，與MRP8/14組相比，咯利普蘭能顯著抑制MRP8/14誘導的促炎因子TNF-α和IL-6的釋放，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effect of rolipram on the releases of TNF-α and IL-6 induced by MRP8/14 in the RAW264.7 cells. A: the releases of TNF-α and IL-6 were measured by LiquiChip; B: the mRNA expression of TNF-α and IL-6 was determined by qPCR. Con： control； R: rolipram; R+M: rolipram+MRP8/14. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon；#P<0.05vsMRP8/14.

圖3 咯利普蘭對MRP8/14促炎性因子TNF-α和IL-6釋放的影響

4 咯利普蘭對MRP8/14促RAW264.7細胞NF-κB P65移位的影響

MRP8/14刺激RAW264.7細胞不同時點，Western blot法檢測胞核內NF-κB P65的蛋白水平，實驗發現MRP8/14刺激細胞60 min時胞核內NF-κB P65蛋白水平達到高峰，隨后，細胞核內NF-κB P65蛋白水平隨著刺激時間的延長逐漸降低，見圖4。根據以上結果我們選取60 min時點刺激細胞，進行間接免疫熒光檢測，結果顯示與對照組相比，MRP8/14能明顯誘導NF-κB P65蛋白的細胞移位，而咯利普蘭+MRP8/14則顯著減弱NF-κB P65蛋白的細胞移位，見圖5。

Figure 4.The effect of MRP8/14 (1.5 mg/L) on the location of NF-κB P65 in the RAW264.7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 min.

圖4 MRP8/14對A549細胞NF-κB P65定位的影響

Figure 5.The effect of rolipram on the location of NF-κB P65 induced by MRP8/14 in RAW264.7 cells. Con： control； R+M: rolipram+MRP8/14.

圖5 咯利普蘭對MRP8/14活化的 NF-κB P65蛋白定位的影響

5 咯利普蘭對MRP8/14促RAW264.7細胞NF-κB P65磷酸化的影響

MRP8/14刺激RAW264.7細胞1 h，用Western blot法檢測NF-κB P65蛋白磷酸化情況，結果顯示與對照組相比，MRP8/14能夠使NF-κB P65發生顯著的磷酸化；而咯利普蘭+MRP8/14組則能顯著減弱NF-κB P65的蛋白磷酸化，見圖6。

Figure 6.The effect of rolipram on the phosphorylation of NF-κB P65 induced by MRP8/14 in the RAW264.7 cells. Con： control； R: rolipram； M: MRP8/14; R+M: rolipram+MRP8/14. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon；#P<0.05vsMRP8/14.

圖6 咯利普蘭對MRP8/14活化的 NF-κB P65蛋白磷酸化的影響

討 論

ALI是臨床上常見的危重癥之一，其不僅是單純意義上的肺部疾病,同時也是全身系統炎癥性疾病的肺部表現,主要表現為炎癥反應和免疫調節失控導致促炎細胞因子釋放,并通過細胞間的信息傳導,炎癥反應進一步放大,促炎與抗炎機制失衡,從而導致肺損傷加重[7-8]。MRP8/14蛋白屬于損傷相關模式分子的成員，有研究發現ALI病人的血清和肺泡灌洗中能檢測到大量MPR8/14蛋白。也有研究稱MRP8/14作為新的炎性組分可以活化肺組織和肺泡巨噬細胞，通過Toll樣受體等進一步激活NF-κB信號通路轉錄合成大量的炎性因子TNF-α，TNF-α的激活又可促使巨噬細胞產生IL-6、IL-8等其它更多的促炎因子，促發級聯反應，從而誘發、加重急性肺損傷[9]。本實驗通過液相芯片技術和qPCR技術證實了MRP8/14可以通過刺激巨噬細胞系RAW264.7細胞產生大量的促炎因子TNF-α、IL-6等。

PDE是降解細胞內第二信使cAMP和環磷酸鳥苷(cGMP)的關鍵酶，參與多種細胞功能調節[10]。迄今，在哺乳動物已經發現了21種PDE基因編碼不同的PDE，而PDE4主要存在于免疫炎癥細胞內，參與多種炎癥反應調節，包括慢性阻塞性肺疾病、哮喘以及炎癥性腸病等[11]。選擇性PDE4抑制劑可通過抑制多種炎癥介質、細胞因子釋放，調節Th1/Th2平衡，抑制白細胞活化、呼吸爆發、抑制細胞黏附因子的表達等來起到抗炎的作用[12]。本課題采用選擇性PDE4抑制劑咯利普蘭預處理RAW264.7細胞，然后給予MRP8/14刺激細胞，液相芯片技術和qPCR結果顯示，咯利普蘭可以有效的降低MRP8/14所致的促炎因子TNF-α和IL-6的表達。

有研究發現咯利普蘭可以通過MKP-1調節絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路介導下游的NF-κB途徑來影響LPS所致的炎性因子TNF-α的表達，從而發揮抗炎作用[13]。也有研究稱當MRP8/14刺激巨噬細胞時，可以通過NF-κB途徑介導大量促炎因子的轉錄合成，其中TNF-α和IL-6就是最先轉錄合成的炎性因子[14-15]；本課題組前期的研究發現MRP8/14可以通過NF-κB途徑調節巨噬細胞向M1型轉化，從而產生大量的炎性因子，像TNF-α、IL-6以及誘導型一氧化氮合酶等。于是，我們推測咯利普蘭是否也可以通過Toll樣受體4激活MAPK信號通路以及下游的NF-κB來調節MRP8/14的促炎作用，本課題初步采用Western blot技術檢測了NF-κB P65量的變化以及間接免疫熒光技術觀察了NF-κB P65的細胞定位情況；同時也采用Western blot技術檢測了NF-κB P65的磷酸化情況。結果提示MRP8/14可以促進NF-κB P65的移位和磷酸化；而咯利普蘭可以顯著減弱由MRP8/14所致的NF-κB P65蛋白的細胞移位現象以及NF-κB P65的蛋白磷酸化。因此我們推測咯利普蘭可能通過干預NF-κB P65的磷酸化來抑制MPR8/14的促炎性因子釋放作用。

綜上所述，MRP8/14可以通過NF-κB途徑促進TNF-α、IL-6等炎癥因子的基因轉錄和合成而放大促炎細胞因子的反應, 從而可能誘發、加重肺損傷。同時，咯利普蘭可通過抑制NF-κB/P65蛋白的核移位和蛋白磷酸化減弱MRP8/14的促炎性因子釋放作用及放大效應，從而為急性肺損傷的治療提供新的思路。

[1] Tang L, Zhang H, Wang C, et al. M2A and M2C macrophage subsets ameliorate inflammation and fibroproliferation in acute lung injury through interleukin 10 pathway[J]. Shock, 2016 Dec 9.[Epub ahead of print]

[2] 黃 林， 楊 晨， 梁 婕， 等. NF-κB介導MRP8/14誘導的人肺泡上皮A549細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(4):701-706.

[3] Achouiti A, Vogl T, Endeman H, et al. Myeloid-related protein-8/14 facilitates bacterial growth during pneumococcal pneumonia[J]. Thorax, 2014, 69(11):1034-1042.

[4] 張俊芳， 張忠敏， 趙 鑫， 等. 磷酸二酯酶4抑制劑咯利普蘭逆轉慢性束縛應激誘導的大鼠抑郁和焦慮樣行為[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(10):1729-1739.

[5] Tavares LP, Garcia CC, Vago JP, et al. Inhibition of phosphodiesterase-4 during pneumococcal pneumonia reduces inflammation and lung injury in mice[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2016, 55(1):24-34.

[6] Wang J, Vodovotz Y, Fan L, et al. Injury-induced MRP8/MRP14 stimulates IP-10/CXCL10 in monocytes/macrophages[J]. FASEB J, 2015, 29(1):250-262.

[7] Sun CY, Xu LQ, Zhang ZB, et al. Protective effects of pogostone against LPS-induced acute lung injury in mice via regulation of Keap1-Nrf2/NF-κB signaling pathways[J]. Int Immunopharmacol, 2016, 32:55-61.

[8] 詹麗英， 李文瀾， 柯 偉， 等. 內毒素急性肺損傷中p38MAPK、NF-κB與HO-1的關系[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(9):1790-1795.

[9] Schwartz MD, Moore EE, Moore FA, et al. Nuclear factor-kappa B is activated in alveolar macrophages from patients with acute respiratory distress syndrome[J]. Crit Care Med, 1996, 24(8):1285-1292.

[10]劉 旭， 程玉芳， 張漢霆， 等. 咯利普蘭對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠學習記憶及海馬PDE4活性的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(6):1096-1100.

[11]Kumar N, Goldminz AM, Kim N, et al. Phosphodieste-rase 4-targeted treatments for autoimmune diseases[J]. BMC Med, 2013, 11:96.

[12]Herve R, Schmitz T, Evain-Brion D, et al. The PDE4 inhibitor rolipram prevents NF-κB binding activity and proinflammatory cytokine release in human chorionic cells[J]. J Immunol, 2008, 181(3):2196-2202.

[13]Korhonen R, Hommo T, Keranen T, et al. Attenuation of TNF production and experimentally induced inflammation by PDE4 inhibitor rolipram is mediated by MAPK phosphatase-1[J]. Br J Pharmacol, 2013, 169(7):1525-1536.

[14]Malleo G, Mazzon E, Siriwardena AK, et al. TNF-α as a therapeutic target in acute pancreatitis： lessons from expe-rimental models[J]. Sci World J, 2007, 7:431-448.

[15]Sunahori K, Yamamura M, Yamana J, et al. The S100A8/A9 heterodimer amplifies proinflammatory cytokine production by macrophages via activation of nuclear factor kappa B and p38 mitogen-activated protein kinase in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Res Ther, 2006, 8(3):R69.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Rolipram represses MRP8/14-induced pro-inflammatory cytokine releases in RAW264.7 cells through NF-κB activation

YANG Chen1, WANG Jun1, HUANG Lin1, LUO Hai-hua2, JIANG Yong2, LIU Ai-hua1

(1DepartmentofRespiratoryDisease,NanfangHospital，2DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:lah47158@aliyun.com.cn)

AIM: To investigate the inhibitory effect of PDE4 inhibitor rolipram on the releases of inflammatory cytokines in mouse macrophages (RAW264.7 cells) induced by myeloid-related protein 8/14 (MRP8/14), and to explore the role of nuclear factor-κB (NF-κB) in this process. METHODS: RAW264.7 cells were treated with MRP8/14. The inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 were determined by LiquiChip and qPCR. In contrast, RAW264.7 cells were pretreated with rolipram prior to MRP8/14 exposure. After MRP8/14 challenge, the inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 were determined by LiquiChip and qPCR. Moreover, the phosphorylation level of NF-κB P65 was determined by Western blot. The nuclear translocation of NF-κB P65 in RAW264.7 cells was detected by indirect immunofluorescence. RESULTS: The results of LiquiChip and qPCR showed that MRP8/14 enhanced the expression of TNF-α and IL-6 (P<0.01)， while pretreatment with rolipram markedly down-regulated the level of inflammatory cytokines induced by MRP8/14 (P<0.05). Meanwhile, MRP8/14 significantly activated the phosphorylation of NF-κB P65, and the protein expression of p65 in the nucleus was increased， while pretreatment with rolipram suppressed the phosphorylation of NF-κB P65 induced by MRP8/14. CONCLUSION: Rolipram may significantly reduce the releases of the inflammatory cytokines induced by MRP8/14 through the NF-κB signaling.

Acute lung injury; Rolipram; Myeloid-related protein 8/14; Inflammatory factors; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2017)06- 1098- 06

2017- 01- 09

2017- 05- 03

國家自然科學基金資助項目(No. 81372030)；國家自然科學基金-廣東省聯合基金重點項目(No. U1601225)；廣東省科技計劃項目(No. 2016A020216015)

R363.2+1； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.023

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