半乳糖凝集素3對內皮細胞生長、遷移及炎癥反應的影響*

仲 琳， 梁平平▲， 龔 磊， 王佳慧， 朱玉潔， 林澤潤， 楊 軍△

(青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院 1心內科， 2生物芯片實驗室， 3中心實驗室，山東 煙臺 264000)

半乳糖凝集素3對內皮細胞生長、遷移及炎癥反應的影響*

仲 琳1， 梁平平1▲， 龔 磊2， 王佳慧3， 朱玉潔1， 林澤潤1， 楊 軍1△

(青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院1心內科，2生物芯片實驗室，3中心實驗室，山東 煙臺 264000)

目的： 探討半乳糖凝集素3(GAL-3)對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)生長、遷移及炎癥反應的影響及其作用機制。方法: 體外培養HUVECs，給予GAL-3重組蛋白2 mg/L或GAL-3短發夾RNA(shRNA)慢病毒載體處理，實驗分為正常對照組、GAL-3重組蛋白處理組、陰性對照組和GAL-3-shRNA組。通過實時熒光定量PCR檢測GAL-3、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、IL-6、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和cyclin D1的mRNA水平；利用Western blot 檢測 GAL-3、MCP-1和IL-6的蛋白表達；利用ELISA檢測MCP-1和IL-6在培養基中的水平；通過CCK-8實驗和劃痕實驗檢測HUVECs的活力和遷移能力；利用Western blot檢測信號分子熱休克蛋白90(HSP90)、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK的蛋白水平。結果: 首先，給予GAL-3重組蛋白處理后，GAL-3、MCP-1和IL-6的mRNA及蛋白水平，MMP-9和cyclin D1的mRNA水平，MCP-1和IL-6在培養基的分泌水平均明顯高于正常對照組；而GAL-3-shRNA感染細胞后，上述分子的表達水平均低于正常對照組和陰性對照組。其次，GAL-3重組蛋白處理后，細胞活力和遷移能力明顯高于正常對照組；而GAL-3-shRNA感染后，細胞活力和遷移能力均低于正常對照組和陰性對照組。此外，GAL-3重組蛋白處理組中，p-ERK1/2和HSP90 的蛋白水平高于正常對照組；而GAL-3-shRNA 組中，p-ERK1/2和HSP90 的蛋白水平均低于正常對照組和陰性對照組。p-JNK的蛋白水平在各組間比較，差異無統計學顯著性。結論: GAL-3促進血管內皮細胞的生長、遷移及炎癥反應的發生，其機制可能與HSP90-ERK1/2信號通路有關。

半乳糖凝集素3； 內皮細胞； 細胞遷移； 炎癥

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個慢性增殖和慢性炎癥的發展過程，研究發現在動脈粥樣斑塊病變部位常存在病理性新生血管的形成和炎癥因子的釋放，它們不僅可以加速AS病變的進展，還可以導致不穩定斑塊的形成。其中血管重塑和急性炎癥是導致斑塊內出血和斑塊破裂重要因素，而血管內皮細胞的異常增殖和遷移是血管重塑的重要環節[1]。

半乳糖凝集素3(galectin-3，GAL-3)是β-半乳糖苷動物凝集素家族成員之一[2]，主要表達于上皮細胞、免疫細胞和巨噬細胞，不僅參與細胞的增殖、遷移、黏附、分化、凋亡和炎癥反應等過程，同時也在心血管疾病，如動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、心肌缺血再灌注、急性冠脈綜合征等的發生發展過程中發揮重要作用[3]。 研究發現，GAL-3作為一種強大的促炎癥因子，可以促使單核細胞向巨噬細胞的分化及其在血管內膜損害部位的聚集，激發炎癥因子如白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等的釋放[4]。同時，GAL-3也可作為細胞增殖的標志物。研究發現，在活化的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中GAL-3的表達水平明顯增加，可通過促進VSMCs增殖和遷移而加速動脈斑塊的形成[5]。Mackinnon等[6]在研究ApoE缺陷鼠模型中發現GAL-3 能促進AS的形成。此外，Falcone等[7]發現，不穩定型心絞痛患者的GAL-3血漿水平顯著高于穩定型心絞痛患者，進一步提示GAL-3與病變斑塊的易損性有關。但是GAL-3對內皮細胞遷移、增殖和炎癥因子表達的影響以及可能的作用機制尚未見報道。本研究通過外源加入GAL-3重組蛋白及利用RNA干擾抑制GAL-3表達的方法，觀察GAL-3在內皮細胞增殖、遷移以及炎癥反應中的作用和機制，為動脈粥樣硬化和不穩定斑塊的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自中國科學院細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM細胞培養液購自Gibco；GAL-3 RNA干擾慢病毒購自上海吉凱基因化學有限公司；兔抗GAL-3、MCP-1和IL-6多克隆抗體購自Abcam；兔抗細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2, ERK1/2)、p-ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和p-JNK單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自Santa Cruz；HRP標記的羊抗兔 II 抗和HRP標記的兔抗鼠 II 抗購自北京中杉金橋；MCP-1和IL-6 ELISA試劑盒購自上海龍騰科技股份有限公司；人源GAL-3重組蛋白購自PeproTech；逆轉錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；real-time PCR試劑盒購自Applied Biosystems；總RNA提取試劑盒、總蛋白質提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由生工生物工程股份有限公司設計合成，見表1。

2 主要方法

2.1 細胞培養 HUVECs常規培養于含10% FBS的DMEM培養液中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。將HUVECs以1×108/L接種于6孔板中培養，細胞每隔2 d換液1次。

表1 引物序列

F: forward； R: reverse.

2.2GAL-3基因缺陷性HUVECs的構建及鑒定 由上海吉凱基因化學技術有限公司以GV248為載體，根據人GAL-3基因序列(NM_002306)設計和合成3條靶向短發夾RNA (short hairpin RNA，shRNA)序列 [shRNA1(5’-TGCCTCGCATGCTGATAACAA-3’)、shRNA2(5’-GAGAACAACAGGAGAGTCATT-3’)和shRNA3(5’-CCTGGAGCACCTGGAGCTTAT-3’)]和1條陰性對照(control) shRNA序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)，并包裝成慢病毒形式。將HUVECs常規培養至30%左右時，用GAL-3-shRNA慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體感染HUVECs 12 h左右，感染復數(multiplicity of infection，MOI)為20。以含10% FBS的1640培養液繼續常規培養，48 h后于熒光顯微鏡下觀察熒光表達，利用 PCR和Western blot實驗驗證基因干擾效率。

2.3 實驗分組 將HUVECs分為4個組：(1)正常對照組：無處理組；(2)GAL-3重組蛋白處理組：在培養基中加入人源GAL-3重組蛋白至終濃度為2 mg/L，培養24 h；(3)陰性對照組：HUVEC感染陰性對照慢病毒載體；(4)GAL-3-shRNA組：HUVECs感染GAL-3-shRNA慢病毒載體。

2.4 實時熒光定量PCR實驗 按照TRIzol試劑盒說明書提取各實驗組總RNA，并測定其濃度。取1 μg總RNA按試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，20 μL實時定量PCR反應體系如下：SYBR? Select Master Mix 10 μL， cDNA(75 ng)1 μL， 上、下游引物各0.5 μL， RNase-free water 8 μL。PCR反應條件為95 ℃ 5 min; 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min, 共40個循環。利用ABI Prism 7900軟件得到每個樣品的Ct值，每組設3個復孔，取Ct平均值，以2-ΔΔCt分析實時定量PCR結果。

2.5 Western blot實驗 根據蛋白提取試劑盒說明書，提取各實驗組細胞的蛋白。根據BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣，SDS-PAGE充分分離后，轉至聚偏氟乙烯膜，封閉液室溫封閉1 h，加入稀釋的 I 抗(GAL-3 1∶5 000； MCP-1 1∶200； IL-6 1∶200； HSP90 1∶1 000； ERK1/2 1∶3 000； p-ERK1/2 1∶3 000； JNK 1∶200； p-JNK 1∶500)，于4 ℃過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應 II 抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL液顯影，β-actin作為內參照，利用ImageJ軟件計算條帶灰度比，利用統計軟件進行統計分析。

2.6 ELISA法檢測MCP-1和IL-6的水平 將正常HUVECs和慢病毒穩定感染的HUVECs接種于6孔板中，待細胞完全貼壁后，棄上清，加入不含FBS的DMEM培養液，其中GAL-3處理組加入人源GAL-3重組蛋白2 mg/L，繼續孵育24 h，收集上清，根據人MCP-1和IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書，檢測培養上清的MCP-1和IL-6分泌水平，樣本及標準品均設3個復孔，結果取均值，以pg/L表示。

2.7 CCK-8法檢測細胞活力 將對數生長期的正常HUVECs和慢病毒穩定感染的HUVECs消化后，以每孔2×103的密度接種于96孔培養板中，常規培養至細胞融合率達60%～70%時，其中GAL-3處理組加入人源GAL-3重組蛋白2 mg/L，處理24 h，棄上清，加入100 μL的無血清DMEM培養基以及10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，用酶聯免疫檢測儀在450 nm處檢測(A)值，細胞活力=實驗組A值/對照組A值，每組設3個復孔，結果取均值，所得比值進行統計分析。

2.8 細胞劃痕實驗 將正常HUVECs和慢病毒穩定感染的HUVECs接種于6孔板中，24 h后細胞融合率達90%，使用200 μL的無菌槍頭在培養皿中央垂直劃線，用PBS清洗2次加入無血清的DMEM培養液，在劃痕處拍照作為初始對照。其中GAL-3處理組加入人源GAL-3重組蛋白2 mg/L，繼續孵育24 h，于顯微鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量劃痕的距離，細胞遷移率(%)= (原劃痕寬度-現劃痕寬度)/原劃痕寬度×100%。

3 統計學處理

用SPSS 19.0軟件包進行統計分析，符合正態分布計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采單因素方差分析(one-way ANOVA) ，用Bonferroni 校正的t檢驗進行各組間均數的兩兩比較，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 GAL-3-shRNA慢病毒干擾效率的檢測結果

GAL-3-shRNA慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體感染HUVECs 48 h，實時定量PCR和Western blot結果顯示，GAL-3-shRNA組的 GAL-3 mRNA 和蛋白表達水平明顯低于正常組和陰性對照組(P<0.05)，其中GAL-3-shRNA2組的GAL-3 mRNA 和蛋白表達水平最低，提示在本實驗中GAL-3-shRNA2組干擾效率最好，并應用于后續實驗中，見圖1。

Figure 1.The lentiviral vector of shRNA reduced the mRNA (A) and protein (B) expression of GAL-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsshControl.

圖1 慢病毒載體干擾GAL-3的mRNA和蛋白表達

2 GAL-3重組蛋白誘導內皮細胞自身GAL-3的表達

GAL-3重組蛋白2 mg/L處理細胞24 h，實時熒光定量PCR和Western blot實驗結果顯示：與正常組相比，GAL-3重組蛋白處理組的GAL-3 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)，提示外源性GAL-3重組蛋白誘導細胞自身GAL-3的表達，增強GAL-3的作用效應，見圖2。

Figure 2.Recombinant GAL-3 protein induced the endogenous mRNA (A) and protein (B) expression of GAL-3 in HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsshControl.

圖2 GAL-3重組蛋白誘導HUVECs內源GAL-3的mRNA表達和蛋白表達

3 GAL-3重組蛋白誘導內皮細胞MCP-1和IL-6的表達

通過實時熒光定量PCR和Western blot對各實驗組檢測發現，與正常組相比，GAL-3重組蛋白處理組MCP-1和IL-6的mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而GAL-3-shRNA組MCP-1和IL-6的mRNA和蛋白表達水平顯著低于正常組和陰性對照組(P<0.05)。同時ELISA對各實驗組上清檢測發現，與正常組相比，GAL-3重組蛋白明顯誘導HUVECs分泌炎癥因子MCP-1和IL-6(P<0.05)。而與正常組和陰性對照組相比，GAL-3-shRNA組MCP-1和IL-6分泌水平明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression (A), secretion (B) and protein expression (C) of MCP-1 and IL-6 in each group were detected respectively by RT- PCR, ELISA and Western blot， respectively. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsshControl group.

圖3 RT-PCR、ELISA和Western blot分別檢測各組MCP-1和IL-6 mRNA表達水平、分泌水平和蛋白表達水平

4 GAL-3誘導內皮細胞MMP-9和cyclin D1的表達

實時定量PCR檢測發現,與正常組相比，GAL-3重組蛋白處理組MMP-9和cyclin D1的mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，而GAL-3-shRNA組MMP-9和cyclin D1的mRNA表達水平顯著低于正常組和陰性對照組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The mRNA expression levels of MMP-9 and cyclin D1 in each group were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsshControl group.

圖4 RT-qPCR檢測各組MMP-9和cyclin D1的mRNA表達水平

5 GAL-3誘導內皮細胞的遷移和增殖

通過劃痕實驗檢測發現：與正常組相比，GAL-3重組蛋白明顯誘導HUVECs的遷移(P<0.05)，而GAL-3-shRNA組HUVECs的遷移能力明顯低于正常組和陰性對照組(P<0.05)，提示GAL-3參與內皮細胞的遷移。此外，通過CCK-8實驗發現，GAL-3重組蛋白處理組的細胞活力明顯高于正常組(P<0.05)，而與正常組和陰性對照組相比，GAL-3-shRNA組的細胞活力則明顯降低(P<0.05)，見圖5。

6 GAL-3參與HSP90-ERK1/2信號通路的激活，而與JNK信號通路無關

與正常組相比，GAL-3重組蛋白顯著誘導HSP90和p-ERK1/2的蛋白水平增高，而GAL-3-shRNA組中的HSP90和p-ERK1/2蛋白水平明顯低于正常組和陰性對照組(P<0.05)，提示GAL-3可以明顯激活HSP90-ERK1/2信號通路。同時，JNK信號通路作為誘導細胞凋亡的重要通路，本實驗檢測發現，p-JNK的蛋白水平在各組間差異無統計學顯著性，提示GAL-3不參與JNK信號通路的激活，見圖6。

Figure 5.The ability of migration (A, ×100) and the viability (B) of HUVECs in each group were detected by wound healing assay and CCK-8 assay， respectively. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsshControl group.

圖5 各組HUVECs的遷移能力和細胞活力

討 論

大量證據表明，血管重塑依賴于內皮細胞的活化，當血管內膜受到外界損傷或炎癥刺激時，可誘導內皮細胞大量遷移、增殖和分泌細胞外基質，從而導致血管重塑，并促使不穩定斑塊的形成，是臨床上急性心血管事件重要的始動環節[8]，因此針對血管內皮細胞的增殖、遷移及炎癥反應的實驗研究，可為臨床不穩定性斑塊的早期識別和干預奠定基礎。本研究通過加入GAL-3重組蛋白及RNA干擾技術，證實GAL-3可誘導HUVECs生長、遷移以及炎癥反應，其機制可能與HSP90/ERK1/2信號通路激活有關。

研究表明，炎癥反應是激活內皮細胞的關鍵，其中GAL-3能促進巨噬細胞活化及單核細胞趨化，增加MCP-1、IL-6、MMP-9等因子的表達，而這些炎癥因子及趨化因子在AS發展中起著重要的作用[2]。MCP-1作為重要的趨化因子，其誘導單核細胞遷移和滲透是激發內皮細胞炎癥因子IL-6等釋放的重要環節[9]。研究表明，阻斷MCP-1表達可以明顯減少血管內皮細胞炎癥反應并起到穩定斑塊的作用。我們的實驗結果發現，HUVECs中炎癥因子MCP-1和IL-6可被GAL-3重組蛋白誘導表達，而GAL-3 RNA干擾則可有效抑制炎癥因子的表達水平，進一步證實GAL-3參與內皮細胞細胞的炎癥反應。此外研究發現，GAL-3 的表達可以作為轉錄的標志，活化狀態細胞GAL-3表達水平高于靜息狀態的細胞[10]，進一步促進炎癥因子的釋放。因此，GAL-3重組蛋白明顯誘導HUVECs自身的GAL-3表達， 從而擴大其自身作用效應，其機制可能與GAL-3激活內皮細胞而使其處于增殖狀態有關，但具體機制尚不清楚

Figure 6.The protein level of HSP90 (A) and the phosphorylation of ERK1/2 (B) and JNK (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsshControl group.

圖6 Western blot檢測檢測各組HSP90、p-ERK1/2和p-JNK的蛋白水平變化

。

此外，細胞外基質的降解是血管重塑重要的內在因素之一，MMP-9通過降解細胞外基質的大多數蛋白質，誘導血管重塑，促使易損斑塊的形成[11]。細胞周期調控細胞的增殖與凋亡，cyclin D1作為重要的細胞周期蛋白，其表達水平高低反映細胞的增殖能力。為了進一步驗證GAL-3對HUVECs的生長和遷移的影響，本研究通過檢測了MMP9、Cyclin D1表達、以及CCK-8增殖實驗和細胞劃痕實驗探討HUVECs的增殖和遷移能力。結果發現，GAL-3能夠調節HUVECs的生長與遷移。因此，GAL-3的促炎癥反應和促生長效應可能是其參與AS不穩定斑塊形成過程主要環節。

HSP90 為作為心臟內源性保護蛋白，外界刺激因素(如熱應激、缺氧、炎癥反應等)可誘導細胞內HSP90 表達增加，以減輕細胞的損傷[12]。此外，研究發現，在大鼠骨髓間充質干細胞中HSP90可以選擇性地增強ERK1/2信號通路，從而調控細胞增殖和遷移[13]。ERK1/2與JNK同屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的成員[14]，ERK1/2主要參與從細胞膜到細胞核的信號轉導，是調控細胞生長、分化、凋亡的重要信號通路。JNK信號通路可受外界應激刺激而被活化，從而引起一系列級聯反應，誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，GAL-3可調控HUVECs的生長與遷移，GAL-3重組蛋白明顯誘導HSP90和ERK1/2磷酸化水平上調，而GAL-3基因干擾可有效抑制HSP90和p-ERK1/2的表達水平，但不影響JNK活性。因此，GAL-3誘導HUVECs生長、遷移以及炎癥反應可能與HSP90/ERK1/2信號通路有關，但與JNK信號通路無關。

綜上所述，GAL-3促進血管內皮細胞生長、遷移及炎癥反應的發生，為防治血管重塑和動脈粥樣硬化提供了新的思路。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of galectin-3 on growth, migration and inflammation of endothe-lial cells

ZHONG Lin1, LIANG Ping-ping1, GONG Lei2, WANG Jia-hui3, ZHU Yu-jie1, LIN Ze-run1, YANG Jun1

(1DepartmentofCardiology，2BiochipLaboratory，3CentralLaboratory,YantaiYuhuangdingHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Yantai264000,China.E-mail:yangjun19640124@163.com)

AIM: To explore the effects of galectin-3 (GAL-3) on the viability, migration and inflammation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and the mechanisms. METHODS: The HUVECs were culturedinvitroand treated with GAL-3 recombinant protein at 2 mg/L or GAL-3 short hairpin RNA (shRNA). The HUVECs were divided into normal group, recombinant GAL-3 group, shControl group and GAL-3-shRNA group. The mRNA expression of GAL-3, monocyte chemotactic protein (MCP)-1, IL-6, matrix metalloproteinase (MMP)-9 and cyclin D1 was detected by real-time quantitative PCR， and the protein expression of GAL-3, IL-6 and MCP-1 was detected by Western blot. The secretion levels of MCP-1 and IL-6 in the culture medium were measured by ELISA. The viability and the ability of migration of the HUVECs were examined by CCK-8 assay and wound healing assay. The protein levels of heat shock protein 90 (HSP90), ERK1/2, p-ERK1/2, JNK and p-JNK were determined by Western blot. RESULTS: The expression of GAL-3, MCP-1 and IL-6 at mRNA and protein levels, the mRNA expression of MMP-9 and cyclin D1, and the secretion levels of MCP-1 and IL-6 in the culture medium were significantly higher than those in normal group (P<0.05) after the HUVECs were treated with GAL-3 recombinant protein. However, these molecules mentioned above in GAL-3-shRNA group were significantly lower than those in normal group and negative control group (P<0.05). Compared with normal group, the viability and migration ability of the HUVECs in recombinant GAL-3 group were significantly increased, but the viability and migration ability of the HUVECs in GAL-3-shRNA group were lower than those in normal group and shControl group (P<0.05). In addition, the protein levels of p-ERK1/2 and HSP90 in recombinant GAL-3 group were higher than those in normal group (P<0.05), but those in GAL-3-shRNA group were lower than those in normal group and shControl group (P<0.05). The protein level of p-JNK was not oviously changed among the 4 groups. CONCLUSION: GAL-3 is involved in regulating the cell growth, migration and the release of inflammatory cytokines in vascular endothelial cells, which may be mediated by HSP90-ERK1/2 signaling pathway.

Galectin-3; Endothelial cells; Cell migration; Inflammation

1000- 4718(2017)06- 1065- 08

2016- 10- 19

2017- 01- 12

國家自然科學基金資助項目(No. 81571636)；山東省自然科學基金資助項目(No. ZR2015HM058)；山東省醫藥衛生發展計劃資助項目(No. 2015WS0017)；煙臺市科技發展計劃項目(No. 2013WS224; No. 2015WS021)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.018

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 13808900219; E-mail: yangjun19640124@163.com

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