VDUP1對乳腺癌細胞MCF-7增殖及遷移的影響

李建華， 徐利強， 倪修文， 孫亞云， 毛惠娜， 吳瑾惠

(嘉興市中心血站， 浙江 嘉興 314000 )

VDUP1對乳腺癌細胞MCF-7增殖及遷移的影響

李建華， 徐利強， 倪修文△， 孫亞云， 毛惠娜， 吳瑾惠

(嘉興市中心血站， 浙江 嘉興 314000 )

目的： 探討過表達/沉默維生素D3上調蛋白1(vitamin D3 up-regulated protein 1，VDUP1)基因對人乳腺癌細胞系MCF-7增殖和遷移能力的影響及相關作用機制。 方法: 通過基因過表達/干擾技術上調/下調乳腺癌細胞系MCF-7中VDUP1基因的表達；實時熒光定量PCR檢測細胞中VDUP1的mRNA表達水平；CCK-8法、BrdU實驗和Transwell細胞遷移實驗分別用于檢測細胞增殖和遷移能力；Western blot檢測細胞中Akt、p-Akt、GSK3β和p-GSK3β的蛋白水平。 結果: 基因過表達/干擾技術可上調/下調乳腺癌細胞系MCF-7中VDUP1基因的表達；過表達VDUP1基因后，MCF-7的細胞活力、DNA合成和細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，而沉默VDUP1基因后，MCF-7的細胞活力、DNA合成和細胞遷移能力則顯著升高(P<0.05)。此外，過表達VDUP1基因可下調p-Akt和p-GSK3β的蛋白水平(P<0.05)，而沉默VDUP1基因的結果則相反。 結論: 改變VDUP1基因表達水平可影響MCF-7細胞的增殖和遷移能力，其作用機制可能與Akt/GSK3β信號通路有關。

維生素D3上調蛋白1； MCF-7細胞； 細胞增殖； 細胞遷移； Akt/GSK3β信號通路

乳腺癌的發生發展是一個多基因參與，多階段的復雜演化過程，其中涉及到多種原癌基因及抑癌基因等的異常表達[1-3]；深入探討其中涉及的基因功能，不僅有助于深化對乳腺癌發病機制的認識，且有助于篩選乳腺癌診療的新靶點。

維生素D3上調蛋白1(vitamin D3 upregulated protein 1，VDUP1)基因，即硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)結合基因，位于人染色體1q21上[4]。已有大量文獻報道VDUP1作為一種抑癌基因，在包括肝癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤中表達異常。研究表明，VDUP1是維持細胞內部微環境穩定的一種多功能蛋白，作為TRX的內源性抑制劑，VDUP1可通過抑制TRX的活性廣泛參與調控細胞的增殖、凋亡及分化等病理生理過程[6-8]。然而有關VDUP1對乳腺癌細胞的具體作用研究甚少。本實驗采用基因過表達/干擾技術上調/下調乳腺癌細胞系MCF-7中VDUP1基因的表達，而后通過CCK-8法、BrdU實驗和Transwell細胞遷移實驗檢測MCF-7細胞的增殖及遷移能力的變化，初步探討VDUP1基因對MCF-7細胞相關生物學功能的影響，此外采用Western blot檢測相關蛋白表達的變化，進一步討論VDUP1基因調控MCF-7細胞的相關機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細胞系MCF-7(中科院細胞庫)；VDUP1過表達質粒及對照質粒(Gene Copoeia)；VDUP1 siRNA及陰性對照siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)；胰蛋白酶和CCK-8試劑(Sigma)；BrdU細胞增殖分析試劑盒(Chemicon)；DMEM培養基及Opti-MEM培養基(Gibco)；Transwell小室(Corning)；Lipofectamine 2000及相關轉染試劑(Invitrogen)；抗Akt、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)、p-Akt、p-GSK3β抗體和HRP標記的抗兔 II 抗(Santa Cruz)。

2 方法

2.1 細胞培養 人乳腺癌細胞系MCF-7常規貼壁培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養條件為5% CO2、37 ℃恒溫培養箱；待細胞生長至培養瓶的約80%時，胰蛋白酶常規進行消化，傳代。

2.2 細胞轉染 取對數生長期的細胞接種于6孔板中(密度為2×108/L)，待細胞生長融合至60%～80%，換無血清的培養基同步化12 h，隨后進行轉染。組別設置為空白對照(control)組、陰性對照(negative control siRNA，Neg)組、VDUP1 siRNA干擾組(siRNA組)、空質粒(vector，Vec)組和VDUP1過表達組(VDUP1組)。將質粒溶解于Opti-MEM培養基中孵育5 min，同時另取Lipofectamine 2000溶入Opti-MEM培養基中孵育5 min；而后將兩者輕柔混合，室溫靜置20 min。然后將混合物加入各組細胞中，置于培養箱中培養6 h后，更換為正常細胞培養基繼續培養48 h。提取細胞蛋白測定轉染效率并進行后續實驗分析。

2.3 CCK-8法和BrdU法檢測各組細胞的增殖水平 接種細胞于96孔板中(每孔2×103個)，處理后加培養基繼續培養22 h，隨后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中繼續培養2 h。于450 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值，每組設3個復孔。另設單孔只加入培養基不加入MCF-7細胞作為空白對照，計算各組細胞的細胞活力。另接種細胞至96孔板中(每孔1×103個)，處理后加培養基繼續培養24 h，隨后加入BrdU，共培養24 h。培養結束后倒出培養液，加入100 μL固定液，室溫孵育30 min，洗板3次。5% FBS封閉30 min。加入甲酰胺100 ℃下變性5 min，冷卻洗滌后加入抗小鼠BrdU單抗，陰性對照組加PBS。蘇木素襯染，顯微鏡下計數，重復實驗6次。

2.4 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測轉染細胞中VDUP1的mRNA表達 收集各組細胞，總RNA的提取按照Trizol說明書進行，所提RNA經紫外分光光度法測定A260值，并進行定量。建立反轉錄反應。VDUP1的上游引物為5’-ACTCGTGTCAAAGCCGTTAGGA-3’，下游引物為5’-AGCTCAAAGCCGAACTTGTACTCA-3’； GAPDH為內參照，其上游引物為5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，下游引物為5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’。PCR擴增條件為：90 ℃ 10 s； 92 ℃ 15 s， 60 ℃ 15 s， 74 ℃ 15 s， 40個循環。反應結束后，標準曲線和擴增曲線由PCR儀器自動生成，所得結果直接在熒光定量操作系統中進行比較分析，目標基因的相對定量用2-ΔΔCt法計算。

2.5 Transwell細胞遷移實驗 胰酶消化收集各組細胞后，用培養基重懸細胞后將細胞接種于Transwell小室的上室中(密度2×108/L)，同時在Transwell小室的下室內加入常規培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h。取出后，棄去上室培養液，用5%戊二醛4 ℃固定15 min；PBS沖洗3次，并用棉簽擦除上室表面的細胞，然后加0.1%結晶紫染色，PBS漂洗后置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數染色細胞的個數(每組細胞計數5個視野取均值)。

2.6 Western blot檢測相關蛋白的表達 離心收集各組經相應處理的細胞，提取總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度進行定量，每道加入80 μg蛋白進行SDS-PAGE，待藍色loading buffer泳出后，將蛋白電轉至PVDF膜上，用含5% 脫脂牛奶的PBS緩沖液封閉90 min，加入相應比例的 I 抗，4 ℃孵育過夜；復溫后再加入相應 II 抗，室溫孵育2 h，化學發光法顯影，定影并沖洗膠片。所得結果經ImageJ軟件行蛋白半定量灰度分析。

3 統計學處理

所有數據采用SPSS 15.0統計軟件進行統計分析。實驗數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 qPCR檢測VDUP1的mRNA表達水平

各組細胞經轉染后，采用qPCR檢測VDUP1的mRNA表達水平。結果顯示，與control組相比，VDUP1組中VDUP1的表達明顯升高，而siRNA組中VDUP1的 mRNA表達顯著降低，提示細胞轉染成功，見圖1。

2 過表達/沉默VDUP1基因后MCF-7細胞增殖能力的變化

過表達/沉默VDUP1基因后，采用CCK-8法檢測細胞活力變化。結果表明，與control 組相比，過表達VDUP1基因后，MCF-7細胞的活力顯著降低；而沉默VDUP1基因后，MCF-7細胞的活力顯著升高。BrdU實驗結果表明，過表達VDUP1基因后，MCF-7細胞的DNA合成顯著低于對照組；而沉默VDUP1基因后，MCF-7細胞的DNA合成顯著高于對照組，見圖2。

Figure 1.The mRNA expression levels of VDUP1 in the MCF-7 cells after transfected with plamid/siRNA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1 MAF-7細胞中轉染質粒/siRNA后VDUP1的 mRNA表達水平

Figure 2.The effects ofVDUP1 over-expression/knockdown on the proliferation of the MCF-7 cells. A: the cell viability was detected by CCK-8 assay; B: the cell proliferation was determined by BrdU assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 過表達/沉默VDUP1基因對MCF-7細胞增殖的影響

3 過表達/沉默VDUP1基因后MCF-7細胞的遷移能力變化

過表達/沉默VDUP1基因后，Transwell遷移實驗檢測MCF-7細胞遷移能力的變化。過表達VDUP1基因可顯著降低MCF-7細胞的遷移能力，而沉默VDUP1基因則顯著增加其遷移能力，見圖3。

4 過表達/沉默VDUP1基因后MCF-7細胞中Akt/GSK3β信號通路活性的變化

過表達/沉默VDUP1基因后，Western blot法檢測細胞中Akt/GSK3β信號通路活性的變化。結果顯示：與control組相比，過表達VDUP1基因后，MCF-7細胞中p-Akt和p-GSK3β的蛋白水平顯著降低；而沉默VDUP1基因后，p-Akt和p-GSK3β的蛋白表達水平則顯著增加，見圖4。

Figure 3.The effects ofVDUP1 over-expression/knockdown on the migration ability of the MCF-7 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3 過表達/沉默VDUP1基因對MCF-7細胞遷移能力的影響

Figure 4.The effects ofVDUP1 over-expression/knockdown on the protein levels of p-Akt and p-GSK3β in the MCF-7 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖4 過表達/沉默VDUP1基因對MCF-7細胞中p-Akt和p-GSK3β蛋白水平的影響

討 論

關于VDUP1基因在腫瘤中的作用，早期的研究顯示其是一種抑癌基因；隨著研究的深入，研究者們發現VDUP1是TRX的內源性抑制劑，不僅廣泛參與調控細胞的增殖、凋亡及分化等病理生理過程，還具有免疫調節作用，并參與炎癥反應及體內抗氧化應激反應[9-11]。本研究在分子水平上，通過構建過表達/沉默VDUP1基因的人乳腺癌MCF-7細胞探討VDUP1基因對MCF-7細胞增殖及遷移的作用。結果發現，當過表達VDUP1基因時，MCF-7細胞的增殖與遷移能力顯著降低，而當沉默VDUP1基因后，MCF-7細胞的增殖與遷移能力則顯著增加，提示VDUP1基因可能與乳腺癌的發生發展有著密切的關系。

關于VDUP1調控細胞病理生理過程的作用機制，大量研究表明，VDUP1是一種細胞內信號分子，其作用主要是通過TRX來發揮的；VDUP1可與TRX活性區的2個半胱氨酸殘基相結合，抑制TRX的活性[12-13]。TRX是一種強力抗氧化劑，可通過抑制細胞凋亡信號ASK1-JNK/p38 MAPK信號通路調控細胞凋亡[14]；且抑制TRX-1還可促進Akt/GSK3β的活化，進而發揮心肌保護效應[15]。此外也有研究提示，VDUP1可通過抑制Akt的磷酸化調控人晶狀體上皮細胞的自噬[16]。Akt/GSK3β通路廣泛存在于細胞中，通過其磷酸化調控下游細胞增殖、凋亡及代謝等相關蛋白的表達，進而促進腫瘤細胞的增殖、加快細胞周期進程、調控腫瘤細胞耐藥性的發生[17-19]。本實驗結果顯示過表達VDUP1后，MCF-7細胞中p-Akt和p-GSK3β的蛋白表達顯著降低，而沉默VDUP1則p-Akt和p-GSK3β的蛋白表達顯著增加，提示VDUP1基因調控MCF-7細胞增殖及遷移可能與Akt/GSK3β信號通路有關，但是VDUP1與Akt/GSK3β信號通路之間的具體關系還有待進一步深入的研究。

綜上所述，本研究在分子水平上，通過構建過表達/沉默VDUP1基因的人乳腺癌MCF-7細胞探討VDUP1的功能。結果發現，過表達VDUP1基因可抑制MCF-7細胞的增殖和遷移能力，沉默VDUP1基因則促進MCF-7細胞的增殖和遷移能力，其作用機制可能與Akt/GSK3β信號通路有關。這提示，VDUP1基因可能與乳腺癌的發生發展有著密切的關系，有望成為乳腺癌診療的新靶點。

[1] Bychkovsky BL, Lin NU. Imaging in the evaluation and follow-up of early and advanced breast cancer: When, why, and how often?[J]. Breast, 2017, 31:318-324.

[2] Kleibl Z, Kristensen VN. Women at high risk of breast cancer: Molecular characteristics, clinical presentation and management[J]. Breast, 2016, 28:136-144.

[3] Luen S, Virassamy B, Savas P, et al. The genomic landscape of breast cancer and its interaction with host immunity[J].Breast, 2016, 29:241-250.

[4] Kwon HJ, Won YS, Suh HW, et al. Vitamin D3 upregulated protein 1 suppresses TNF-α-induced NF-κB activation in hepatocarcinogenesis[J]. J Immunol, 2010, 185(7):3980-3989.

[5] Solanas M, Moral R, Garcia G, et al. Differential expression of H19 and vitamin D3 upregulated protein 1 as a mechanism of the modulatory effects of high virgin olive oil and high corn oil diets on experimental mammary tumours[J]. Eur J Cancer Prev, 2009, 18(2):153-161.

[6] Lu J, Holmgren A. The thioredoxin antioxidant system[J]. Free Radic Biol Med, 2014, 66:75-87.

[7] Huang W, Nie W, Zhang W, et al. The expression status of TRX, AR, and cyclin D1 correlates with clinicopathological characteristics and ER status in breast cancer[J]. Onco Targets Ther, 2016, 9:4377-4385.

[8] Kim SY, Suh HW, Chung JW, et al. Diverse functions of VDUP1 in cell proliferation, differentiation, and diseases[J]. Cell Mol Immunol, 2007, 4(5):345-351.

[9] Cai Z, Liu J, Bian H, et al. Astragaloside IV ameliorates necrotizing enterocolitis by attenuating oxidative stress and suppressing inflammation via the vitamin D3-upregulated protein 1/NF-κB signaling pathway[J]. Exp Ther Med, 2016, 12(4):2702-2708.

[10]蔡紹曦， 高 楓， 丁彥青， 等. 維生素D3上調蛋白1在哮喘嗜酸粒細胞中的表達及其與細胞活化的關系[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(6):1120-1124.

[11]Kwon HJ, Hong SK, Yoon WK, et al. Vitamin D3 up-regulated protein 1 controls the priming phase of liver regeneration[J]. J Vet Sci, 2013, 14(3):257-262.

[12]Spindel ON, World C, Berk BC. Thioredoxin interacting protein: redox dependent and independent regulatory mechanisms[J]. Antioxid Redox Signal, 2012, 16(6):587-596.

[13]Chen Z, Lopez-Ramos DA, Yoshihara E, et al. Thioredoxin-binding protein-2 (TBP-2/VDUP1/TXNIP) regulates T-cell sensitivity to glucocorticoid during HTLV-I-induced transformation[J]. Leukemia, 2011, 25(3):440-448.

[14]Jin R, Gao Y, Zhang S, et al. Trx1/TrxR1 system regulates post-selected DP thymocytes survival by modulating ASK1-JNK/p38 MAPK activities[J]. Immunol Cell Biol, 2015, 93(8):744-752.

[15]Perez V, D Annunzio V, Mazo T, et al. Ischemic postconditioning confers cardioprotection and prevents reduction of Trx-1 in young mice, but not in middle-aged and old mice[J]. Mol Cell Biochem, 2016, 415(1-2):67-76.

[16]Zhou J, Yao K, Zhang Y, et al. Thioredoxin binding protein-2 regulates autophagy of human lens epithelial cells under oxidative stress via inhibition of Akt phosphorylation[J]. Oxid Med Cell Longev, 2016, 2016:4856431.

[17]徐立群， 張榮華， 鄒 瑩， 等. 參慈膠囊聯合順鉑通過PI3K/AKT/mTOR信號通路逆轉人肺腺癌順鉑耐藥的機制研究[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(3): 500-504.

[18]Shen H, Li L, Yang S, et al. MicroRNA-29a contributes to drug-resistance of breast cancer cells to adriamycin through PTEN/AKT/GSK3β signaling pathway[J]. Gene, 2016, 593(1):84-90.

[19]Su YJ, Lin WH, Chang YW, et al. Polarized cell migration induces cancer type-specific CD133/integrin/Src/Akt/GSK3β/β-catenin signaling required for maintenance of cancer stem cell properties[J]. Oncotarget, 2015, 6(35):38029-38045.

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of VDUP1 on proliferation and migration of human breast cancer MCF-7 cells

LI Jian-hua, XU Li-qiang, NI Xiu-wen, SUN Ya-yun， MAO Hui-na, WU Jin-hui

(JiaxingBloodCenter,Jiaxing314000,China.E-mail:nixiuwen322904@163.com)

AIM: To investigate the effect of vitamin D3 up-regulated protein 1 (VDUP1) gene over-expression/knockdown on the proliferation and migration of human breast cancer MCF-7 cells and its related mechanisms.METHODS: Gene over-expression/interference techniques were used to up-regulate/down-regulate the expression of VDUP1 in the MCF-7 cells. The mRNA expression of VDUP1 was detected by qPCR. CCK-8, BrdU and Transwell assays were used to measure the cell viability, proliferation and migration, respectively. The protein levels of Akt, p-Akt, GSK3β and p-GSK3β were determined by Western blot.RESULTS: The mRNA expression of VDUP1 was up-regulated after transfection withVDUP1 over-expression plasmid (P<0.05), and down-regulated after transfection withVDUP1 siRNA (P<0.05). Over-expression ofVDUP1 significantly inhibited MCF-7 cell proliferation and migration (P<0.05), while knockdown ofVDUP1 enhanced cell proliferation and migration (P<0.05). Furthermore, over-expression ofVDUP1 up-regulated the protein levels of p-Akt and p-GSK3β (P<0.05). Inverse results were obtained after knockdown ofVDUP1. CONCLUSION: The viability and migration ability of MCF-7 cells are inhibited by over-expression ofVDUP1 but enhanced byVDUP1 knockdown, which may be related with Akt/GSK3β pathway.

Vitamin D3 up-regulated protein 1; MCF-7 cells; Cell proliferation; Cell migration; Akt/GSK3β pathway

1000- 4718(2017)06- 1060- 05

2017- 04- 01

2017- 04- 24

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.017

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0573-83386959； E-mail: nixiuwen322904@163.com