miR-125b通過下調HAX-1的表達提高CD133+ SW480細胞對順鉑的敏感性

潘海強， 沈 鋒， 崔焌輝， 蔡 珂， 都志軍

(浙江省立同德醫院肛腸科，浙江 杭州 310012)

miR-125b通過下調HAX-1的表達提高CD133+SW480細胞對順鉑的敏感性

潘海強△， 沈 鋒， 崔焌輝， 蔡 珂， 都志軍

(浙江省立同德醫院肛腸科，浙江 杭州 310012)

目的： 探討miR-125b在CD133+結直腸癌細胞中發揮的作用并研究其是否和順鉑的體外治療有關。方法: 用RT-qPCR方法檢測miR-125b在常規SW480腫瘤細胞及CD133+SW480腫瘤細胞中的表達水平。流式細胞術檢測miR-125b和順鉑對SW480細胞系中CD133+細胞比例的影響。MTT法檢測miR-125b對順鉑殺傷CD133+SW480細胞能力的影響。利用生物信息學及Western blot方法驗證miR-125b是否調節CD133+SW480細胞中HAX-1的表達。運用JC-1染色、Annexin V染色及Western blot方法研究miR-125b影響順鉑療效的信號通路的效應。結果: CD133+SW480細胞中的miR-125b表達水平顯著低于正常結直腸上皮細胞系FHC和常規SW480腫瘤細胞。順鉑體外單獨治療能提高SW480細胞系中CD133+細胞的比例，然而聯用miR-125b模擬物后CD133+SW480細胞的比例顯著下降。MTT實驗結果表明miR-125b可顯著增強順鉑對CD133+SW480細胞的殺傷活性。Western blot實驗表明miR-125b的靶基因可能為HAX-1。miR-125b聯合順鉑可引起CD133+SW480細胞線粒體膜電位的喪失并誘導線粒體內細胞色素C的釋放，進而引起細胞凋亡。轉染HAX-1表達載體后miR-125b聯合順鉑對CD133+SW480細胞的凋亡誘導效應顯著降低。結論: miR-125b通過下調HAX-1的表達提高CD133+結直腸癌細胞對順鉑的敏感性。

miR-125b; HAX-1; 細胞色素C; 順鉑; CD133+結直腸癌細胞

腫瘤干細胞是腫瘤組織細胞群體中一群具有高度自我更新能力的腫瘤細胞，它們具有干細胞樣的特征且它們的致瘤性要顯著高于常規腫瘤細胞，有文獻報道CD133+腫瘤細胞具有干細胞特性，是導致腫瘤術后復發的重要因素，并且腫瘤干細胞對化療有較強的抵抗性[1-2]。結直腸癌是一種常見的消化道腫瘤，發病率和致死率都非常高[3]，對于不適宜進行手術治療的晚期結直腸癌患者而言，化療是一項重要的治療手段。順鉑是治療結直腸癌的一線藥物，然而結直腸癌干細胞對順鉑的高度抵抗性往往造成化療的失敗[4]，因此采取新的方法提高結直腸癌干細胞對順鉑的敏感性具有十分重要的意義。

微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)是一種細胞內源性的非編碼單鏈RNA，它們能與目標mRNA的3’UTR發生特異性結合，抑制mRNA的轉錄并使之降解，從而調節相應基因的表達[5]。研究表明miRNA能調節約30%的蛋白質編碼基因，因此miRNA在細胞各種生理活動中發揮調節作用，影響細胞的增殖、分化、凋亡等功能[6]。本研究的目的在于探討miR-125b是否能調節CD133+結直腸癌細胞對順鉑治療的敏感性。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞培養 人正常結直腸上皮細胞系FHC[7]和人結腸癌細胞系SW480購于ATCC。CD133+SW480細胞用流式細胞儀進行分選，CD133陽性的結直腸癌細胞被認為是腫瘤干細胞[8]。簡要步驟如下：收集SW480細胞并用生理鹽水洗3次。在單細胞懸液中加入CD133-FITC熒光抗體在冰上孵育40 min，孵育后用BD FACSCalibur流式細胞儀以CD133為標記進行分選。常規結直腸癌細胞系培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中；分選的CD133+SW480細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，并加入青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)。所有細胞均在37 °C恒溫培養箱中培養，通入5% CO2。

1.2 實驗試劑 順鉑、噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]和凋亡檢測試劑盒購于Sigma；線粒體分離試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；DMEM培養基購于Gibco；蛋白提取液、以及兔抗人HAX-1、細胞色素C和β-actin抗體購于CST；CD133-FITC熒光抗體購于BD；miR-125b模擬物和陰性對照寡核苷酸(miR-NC)購于上海吉瑪生物；pcDNA3.1質粒、Trizol試劑和Lipofectamine 2000購于Invitrogen；SYBR Green試劑購于TaKaRa；ECL試劑盒購于Pierce；JC-1購于Molecular Probes。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 熒光定量PCR檢測miR-125b的表達 將培養細胞的總RNA用Trizol試劑按操作說明書進行提取，之后以所提取的總RNA為模板，采用莖環法用miR-125b特異性引物進行逆轉錄。miR-125b的逆轉錄引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGACTC-3′。對miR-125b的定量PCR擴增使用SYBR Green試劑并按其試劑說明書進行操作，以U6 snRNA作為內參照。

2.2 質粒構建和轉染 將HAX-1基因cDNA全長序列以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成HAX-1重組真核表達質粒。使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟將2 mg/L HAX-1質粒轉染入CD133+SW480細胞中。

2.3 細胞活力檢測 將常規SW480細胞或CD133+SW480細胞按照每孔5×103接種在96孔板上，按照實驗設計將50 nmol/L的miR-NC或miR-125b用Lipofectamine 2000試劑轉染入細胞中，培養24 h，然后更換新鮮培養基再加(0～20 μmol/L)順鉑培養48 h。藥物處理完畢后加入20 mL MTT(5 g/L)培養4 h，移除孔內培養基，加入100 μL二甲亞砜，570 nm波長下測定吸光度(A)。細胞活力結果用實驗組與對照組的A值比值表示。

2.4 CD133+SW480細胞所占比例測定 將SW480細胞按每孔2×106接種在6孔板上，分為對照組、miR-125b組、順鉑組和順鉑+miR-125b組。對照組為SW480細胞轉染miR-NC培養72 h；順鉑組為SW480細胞轉染miR-NC培養24 h后加入10 μmol/L的順鉑培養48 h；miR-125b組為SW480細胞轉染miR-125b培養72 h；順鉑+miR-125b組為SW480細胞轉染miR-125b培養24 h后加入10 μmol/L的順鉑培養48 h。藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌2次，加入CD133抗體在暗處孵育20 min后將細胞用流式細胞儀進行分析，計算CD133+的SW480細胞所占總的SW480細胞的比例。

2.5 線粒體分離 將CD133+SW480細胞按每孔2×106接種在6孔板上，按照實驗設計將50 nmol/L的miR-NC、miR-125b及2 mg/L HAX-1質粒轉染入CD133+SW480細胞中，培養24 h，然后更換新鮮培養基再加10 μmol/L的順鉑培養48 h。收集細胞，之后用線粒體分離試劑盒按照說明書操作步驟將完整的線粒體從SW480細胞質中分離出來。

2.6 Western blot實驗 將CD133+SW480細胞按每孔2×106接種在6孔板上，按照實驗設計將50 nmol/L的miR-NC、miR-125b及2 mg/L HAX-1質粒轉染入CD133+SW480細胞中，培養24 h，然后更換新鮮培養基再加10 μmol/L的順鉑培養48 h。收集細胞，將細胞用生理鹽水洗滌2遍后用蛋白提取液提取總蛋白質。將總蛋白質用12.5% SDS-PAGE分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用HAX-1、細胞色素C或β-actin單克隆抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。另外，線粒體中細胞色素C的釋放率用細胞質中的細胞色素C表達水平與線粒體中的細胞色素C的表達水平的比值表示。

2.7 細胞凋亡試驗 將CD133+SW480細胞按每孔2×106接種在6孔板上，按照實驗設計將50 nmol/L的miR-NC、miR-125b及2 mg/L HAX-1質粒轉染入CD133+SW480細胞中，培養24 h，然后更換新鮮培養基再加10 μmol/L的順鉑培養48 h。之后將細胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶(propidium iodide，PI)和Annexin V加入細胞中孵育20 min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin V陽性細胞即為凋亡細胞。

2.8 線粒體膜電位檢測 將CD133+SW480細胞按每孔2×106接種在6孔板上，按照實驗設計將50 nmol/L的miR-NC、miR-125b及2 mg/L HAX-1質粒轉染入CD133+SW480細胞中，培養24 h，然后更換新鮮培養基再加10 μmol/L的順鉑培養48 h。之后將細胞用生理鹽水洗滌2次，加入5 μmol/L JC-1孵育20 min，采用流式細胞術檢測CD133+SW480細胞線粒體膜電位的變化，細胞的紅色熒光越強表明線粒體膜電位越高[9]。

3 統計學處理

實驗重復3次，實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示并用SPSS 15.0統計分析軟件進行處理。兩組間均數的比較采用 Student’st檢驗，多組間均數的比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較行Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-125b增強CD133+SW480細胞對順鉑的敏感性

熒光定量PCR實驗結果顯示結腸癌細胞系SW480的miR-125b表達水平顯著低于正常結腸上皮細胞系FHC。更為重要的是，分離出的CD133+SW480細胞與常規SW480細胞相比，其miR-125b的表達水平進一步下降(圖1A)，提示miR-125b可能在CD133+結直腸癌細胞中發揮抑制作用。MTT實驗結果顯示CD133+SW480細胞對順鉑的敏感性顯著低于常規SW480細胞(圖1B)，表明CD133+SW480細胞對順鉑存在抵抗性。為了探討miR-125b是否與CD133+SW480細胞對順鉑的敏感性有關，本實驗在SW480細胞中轉染miR-125b模擬物，熒光定量PCR實驗結果顯示轉染miR-125b模擬物能顯著提高腫瘤細胞中的miR-125b表達水平(圖1C)。流式細胞術實驗結果顯示順鉑單獨治療能顯著提高SW480細胞系中CD133+細胞的比例，然而聯用miR-125b后，CD133+SW480細胞的比例顯著下降(圖1D)。同時，細胞活力實驗結果顯示轉染miR-125b能顯著提高順鉑對CD133+SW480細胞的殺傷活性(圖1E)。這些實驗結果表明miR-125b能顯著降低CD133+SW480細胞對順鉑的抵抗性。

2 miR-125b調控CD133+SW480細胞HAX-1的表達

生物信息學(http://www.targetscan.org/)結果表明HAX-1 mRNA 3’UTR的第84～90位堿基序列(CUCAGGG)與miR-125b互補結合，提示HAX-1可能是miR-125b的靶點。Western blot實驗結果顯示CD133+SW480細胞的HAX-1表達水平顯著高于常規SW480細胞(圖2A)，結合圖1的結果，表明在結直腸癌細胞中miR-125b的表達水平與HAX-1呈負相關。通過進一步的實驗結果顯示在CD133+SW480細胞中轉染miR-125b 模擬物后HAX-1的表達水平顯著下降(圖2B)，表明miR-125b能調節CD133+SW480細胞中HAX-1的表達水平。

Figure 1.miR-125b increased the sensitivity of CD133+SW480 cells to cisplatin. A: the expression of miR-125b was significantly down-regulated in the CD133+SW480 cells; B: the sensitivity to cisplatin in the CD133+SW480 cells was significantly lower than that in the routine SW480 cells; C: transfection with miR-125b mimics significantly increased the expression of miR-125b in tumor cells; D: miR-125b inhibited cisplatin-dependent enrichment of the CD133+SW480 cell population; E: miR-125b significantly enhanced the cytotoxicity of cisplatin to the CD133+SW480 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFHC;#P<0.05vsroutine SW480 cells;△P<0.05vsmiR-NC group;＄P<0.05vscisplatin group.

圖1 miR-125b增強CD133+SW480細胞對順鉑的敏感性

3 miR-125b聯合順鉑誘導CD133+SW480細胞發生線粒體途徑的凋亡

流式細胞術實驗結果顯示miR-125b能顯著增強順鉑對CD133+SW480細胞線粒體膜電位的損傷，然而轉染HAX-1表達載體能顯著抑制miR-125b的這種協同作用(圖3A)，表明miR-125b能通過線粒體途徑增強順鉑對CD133+結直腸癌細胞的生物活性。Western blot實驗結果顯示順鉑聯合miR-125b能顯著誘導CD133+SW480細胞中的細胞色素C從線粒體中釋放到細胞質中(圖3B)，從而誘導CD133+SW480細胞發生凋亡(圖3C)。另外，轉染HAX-1表達載體后順鉑聯合miR-125b誘導的細胞色素C的釋放(圖3B)和凋亡(圖3C)的發生受到顯著抑制，表明miR-125b通過下調HAX-1的表達促進順鉑誘導的線粒體途徑的凋亡。

討 論

研究表明miR-125b在多種腫瘤中發揮抗腫瘤作用，如zhao等[10]發現miR-125b在膀胱癌細胞中表達降低，同時過表達的miR-125b能抑制膀胱癌細胞的增殖、轉移和細胞周期。在卵巢癌細胞中，miR-125b被報道能通過下調EIF4EBP1基因的表達抑制腫瘤細胞的侵襲轉移能力[11]。此外，文獻報道miR-125b在骨肉瘤細胞中能下調Bcl-2蛋白的表達而提高順鉑的抗腫瘤活性[12]，表明miR-125b可能與腫瘤的化療敏感性有關。在本研究中，體外實驗顯示結腸癌細胞系SW480中的miR-125b水平顯著低于正常結腸上皮細胞系FHC，提示miR-125b在結腸癌中同樣起腫瘤抑制作用，是一個抑癌因子，這與文獻報道一致。更為重要的是，實驗結果顯示miR-125b在CD133+SW480細胞中異常低表達，提示miR-125b在這類腫瘤細胞中有重要的作用。

Figure 2.miR-125b regulated the expression ofHAX-1 gene. A: the expression of HAX-1 was significantly up-regulated in the CD133+SW480 cells; B: the expression of HAX-1 was down-regulated by miR-125b in the CD133+SW480 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFHC cells;#P<0.05vsroutine SW480 cells;△P<0.05vsmiR-NC group;▲P<0.05vsmiR-125b group.

圖2 miR-125b調節HAX-1基因的表達

腫瘤干細胞對化療的低敏感性是造成腫瘤化療失敗的重要原因[13]，在本研究中，當用順鉑單獨處理結直腸癌細胞系SW480后發現，SW480細胞系中CD133陽性的腫瘤細胞比例顯著提高，而CD133+的腫瘤細胞對順鉑的敏感性顯著低于CD133-的腫瘤細胞，致使CD133+SW480細胞在順鉑治療后存活下來從而引起所占比例的升高。當用miR-125b進行聯合治療后，由于CD133+SW480細胞在miR-125b的作用下對順鉑的敏感性顯著提高，致使CD133+的腫瘤細胞所占比顯著下降，表明miR-125b能以CD133+的腫瘤細胞為靶點提高順鉑對結直腸癌的治療效果。

HAX-1是一種定位在線粒體外膜上的抗凋亡蛋白[14]。研究表明過表達的HAX-1能阻礙腫瘤細胞的凋亡途徑，抑制由藥物或其它環境因素引起的腫瘤細胞線粒體的損傷，因此包括結直腸癌在內的多種腫瘤細胞的HAX-1往往過度表達[15]。為了研究miR-125b在結腸癌腫瘤干細胞中的作用機制，作者通過TargetScan在線工具尋找miR-125b的靶點并用Western blot實驗驗證，結果表明在CD133+SW480腫瘤細胞中，HAX-1表達水平受miR-125b的調節。miR-125b聯合順鉑能顯著降低CD133+SW480細胞的線粒體膜電位，進而促使細胞色素C這一凋亡誘導物質[16]從線粒體中釋放到細胞質中，導致CD133+SW480細胞發生顯著的凋亡。同時，HAX-1表達質粒能減弱這種效應，表明miR-125b可通過下調CD133+結直腸癌細胞HAX-1的表達水平促進順鉑依賴的線粒體途徑的凋亡。

綜上所述，本研究證明了miR-125b能顯著提高CD133+結直腸癌細胞對順鉑的敏感性。通過機制研究我們發現miR-125b通過下調HAX-1的表達促進順鉑對CD133+腫瘤細胞線粒體的損傷作用進而誘導細胞細胞色素C的釋放和凋亡的發生。這些研究為如何提高順鉑治療效果提供了新的思路和理論依據。

Figure 3.Combination of cisplatin and miR-125b induced mitochondrium-related apoptosis in the CD133+SW480 cells. A: miR-125b enhanced the cisplatin-induced decrease in mitochondrial membrane potential; B: miR-125b enhanced the cisplatin-induced release of cytochrome C; C: miR-125b enhanced the cisplatin-induced apoptosis in the CD133+SW480 cells.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vscisplatin group;&P<0.05vscisplatin+miR-125b group.

圖3 miR-125b聯合順鉑誘導CD133+SW480細胞發生線粒體途徑的凋亡

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

miR-125b increases sensitivity of CD133+colorectal cancer cells to cisplatin by down-regulating HAX-1 expression

PAN Hai-qiang, SHEN Feng, CUI Jun-hui, CAI Ke, DU Zhi-jun

(DepartmentofProctology,TongdeHospitalofZhejiangProvince,Hangzhou310012,China.E-mail:tongdepanhaiqiang@163.com)

AIM: To investigate the role of miR-125b in regulating the sensitivity of CD133+colorectal cancer cells to cisplatin. METHODS: The expression of miR-125b was detected by RT-qPCR in the routine SW480 cells and CD133+SW480 cells. Flow cytometry analysis was performed to measure the percentage of CD133+cell population in the SW480 cell line treated with miR-125b and cisplatin. MTT assay was performed to evaluate the effect of miR-125b on the cisplatin-induced cell death in the CD133+SW480 cells. Bioinformatics and Western blot were performed to determine whether the expression of HAX-1 was regulated by miR-125b. JC-1 staining, Annexin V staining and Western blot analysis were used to study the pathway of apoptosis in the CD133+SW480 cells co-treated with miR-125b and cisplatin. RESULTS: The expression of miR-125b was significantly lower in the CD133+SW480 cells than that in the routine SW480 cells and normal colonic epithelial FHC cells. Treatment with cisplatin alone increased the percentage of CD133+SW480 cell population. However, miR-125b significantly inhibited the enrichment of CD133+cell population induced by cisplatin. In addition, the results of MTT assay showed that the anti-tumor effect of cisplatin was significantly enhanced when the miR-125b was transfected into the CD133+SW480 cells. The results of Western blot indicated that theHAX-1 gene was the target of miR-125b. Furthermore, the apoptosis induced by the combination of miR-125b and cisplatin was dependent on the dysfunction of mitochondrial membrane, leading to the release of cytochrome C into the cytoplasm and the subsequently activation of apoptosis in the CD133+SW480 cells. CONCLUSION: miR-125b increased the sensitivity of CD133+colo-rectal cancer cells to cisplatin by down-regulating the expression of HAX-1.

miR-125b; HAX-1; Cytochrome C; Cisplatin; CD133+colorectal cancer cells

1000- 4718(2017)06- 1053- 07

2016- 10- 24

2017- 01- 12

R730.23; R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.016

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0571-89972372; E-mail： tongdepanhaiqiang@163.com