Taxol對宮頸癌U14細胞增殖、凋亡及α2,6-SA和ST6Gal mRNA表達的影響*

高雪松， 王曉玉

(暨南大學第一附屬醫院婦產科，廣東 廣州 510632)

Taxol對宮頸癌U14細胞增殖、凋亡及α2,6-SA和ST6Gal mRNA表達的影響*

高雪松， 王曉玉△

(暨南大學第一附屬醫院婦產科，廣東 廣州 510632)

目的： 研究泰素(Taxol)對小鼠宮頸癌U14細胞株增殖、凋亡以及α2,6-唾液酸(SA)和α2,6-唾液酸轉移酶(ST6Gal)mRNA表達的影響，為進一步探討宮頸癌Taxol化療機制提供新思路。方法: Taxol處理U14細胞后，MTT檢測Taxol對U14細胞的IC50值。流式細胞術檢測細胞α2,6-SA、細胞凋亡相關因子(Bcl-2、Bax、caspase 8和caspase 3)、凋亡率和細胞周期改變。 qPCR檢測ST6Gal1 和ST6Gal2 mRNA的表達。結果: 與對照組相比，Taxol對U14細胞有明顯的抑制作用，減弱α 2，6-SA熒光強度，上調Bax表達，下調Bcl-2表達，降低Bcl-2/Bax比值，并增強caspase 8和caspase 3活性；Taxol處理顯著增加U14細胞凋亡率及S期細胞和G2/M期細胞比率，此外還下調ST6Gal1 mRNA表達。結論: α2,6-SA和ST6Gal可能參與了Taxol對U14細胞細胞周期和凋亡調控的多重作用。

泰素; 細胞凋亡； 細胞周期； α2,6-唾液酸； α2,6-唾液酸轉移酶

近年來，泰素(Taxol；紫杉醇注射液)已成為晚期宮頸癌化療常用的治療藥物。研究表明，細胞表面唾液酸化水平的改變與細胞的癌變、腫瘤的進展、轉移及預后顯著相關。因而，在癌癥進展中檢測唾液酸有助于癌癥診斷，評估療效和預后。根據與糖殘基的連接方式,唾液酸(sialic acid，SA)可分為α2，3-、α2，6-和α2，8- 三大類，細胞表面唾液酸化是由唾液酸轉移酶(sialyltransferase，ST)催化，α2,6-唾液酸轉移酶(α2,6-sialyltransferase，ST6Gal)成員包括ST6Gal1和ST6Gal2。α2, 6-唾液酸化與 ST6Gal的活性密切相關。文獻報道，α2,6-唾液酸(α2,6-SA)和ST6Gal1在宮頸癌中呈高表達[1]，但它們在Taxol治療宮頸癌中的改變及其作用，報道甚少。子宮頸癌是全球女性僅次于乳腺癌的第二大常見癌癥，宮頸癌的發生發展機制十分復雜。本實驗旨在通過觀察Taxol對小鼠宮頸癌U14細胞增殖、凋亡及α2,6-SA和ST6Gal表達的影響，為進一步探討宮頸癌Taxol化療機制提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠宮頸癌 U14 細胞株購自中國醫學科學院腫瘤研究所；Taxol(紫杉醇注射液)購自Bristol-Myers Squibb；全自動酶標儀(Bio-Rad)；FACSAria流式細胞儀和Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒(BD)；α2,6-SA FITC-SNA試劑盒(Vector)；Bcl-2、Bax和caspase-8試劑盒(SCBT)；caspase-3試劑盒(CST)；Cell Cycle Assay Kit 購自Abcam；qPCR所用試劑和所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成提供；CFX實時熒光定量 PCR 儀 (Roche)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 U14細胞用含 10% 胎牛血清 的 DMEM 高糖培養液在 37 ℃、5% CO2的條件下培養，所有后續實驗均在細胞處于對數生長期時進行。

2.2 MTT檢測 取對數生長期U14細胞，分未加藥物常規培養的U14細胞為對照(control)組和Taxol處理組，其中Taxol組分為7個不同濃度的亞組。首先將4×107/L單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板。Taxol組再分別加入依次以4倍比稀釋的Taxol，終濃度分別為60 mg/L、15 mg/L、3.75 mg/L、0.938 mg/L、0.234 mg/L、0.059 mg/L和0.015 mg/L。加藥后，將細胞分別培養24 h、48 h和72 h，然后，行常規MTT檢測，于全自動酶標儀，570 nm波長處測定各孔吸光度，計算不同Taxol濃度孵育的細胞存活率，繪制藥物濃度-細胞存活曲線并做線性回歸，通過IC50軟件計算出相應的IC50值。

2.3 流式細胞術檢測U14 細胞α2,6-SA、Bcl-2、Bax、caspase 8和caspase 3的表達及細胞凋亡和周期 選MTT檢測中Taxol達到較好殺傷效果的IC50值處理的U14細胞為Taxol組，常規培養的U14細胞為對照組。嚴格按照檢測項目各自試劑盒說明書操作，Cell Quest 軟件分析樣品，重復進行3次。

2.4 qPCR檢測ST6Gal mRNA表達 qPCR所用引物如下: ST6Gal1(檢測3個剪接體的同源序列)上游引物5’-CCACTCAGCCCCTGGTGT-3’，下游引物5’-CAGCTCGAAACACCGAAGC-3’；ST6Gal2上游引物5’-TGGCTGTCCAGCAGCACTTT-3’，下游引物5’-AGCAATCCTGCGGCACCTAT-3’;GAPDH的上游引物5’-TGGGTGTGAACCACGAGAAATAT-3’，下游引物5’-CAGAGGGGCCATCCACAGTC-3’。嚴格按照試劑盒說明書操作，應用qPCR儀進行檢測。反應條件: 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s， 40個循環； 熔解溫度70～95 ℃。收集熒光信號，繪制擴增曲線，計算mRNA的2-ΔΔCt相對表達量。將Taxol組分為3個亞組(10 mg/L組、20 mg/L組和30 mg/L組)，常規培養的U14細胞為對照組，GAPDH作為內參照，行qPCR檢測，依據CFX Manager軟件進行基因表達分析，獲取ST6Gal1 mRNA和 ST6Gal2 mRNA相對表達水平，實驗重復進行3次。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間均數的比較采用t檢驗，多組間均數的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MTT實驗結果

隨著Taxol濃度梯度的遞增和時間的延長，U14細胞存活率呈下降趨勢。24 h，IC50=168.8 mg/L；48 h，IC50=22.15 mg/L；72 h，IC50=8.04 mg/L，隨著Taxol作用時間的延長,IC50值逐漸降低。3個時間段相比，48 h的存活率曲線與線性回歸直線方程擬合的趨勢效果較佳，細胞的生長抑制呈明顯的時效和量效關系，見圖1。因此，選擇IC50值 22.15 mg/L或相近濃度10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L作用于U14細胞48 h，作為后續實驗的作用濃度和作用時間。

Figure 1.The dose-effect curve and linear regression of mouse cervical cancer cell line U14 treated with various concentrations (0.015 mg/L～60 mg/L) of Taxol for 48 h.

圖1 Taxol孵育U14細胞48 h量效曲線與線性回歸

2 流式細胞術檢測結果

依據MTT實驗結果，Taxol組采用濃度為22.15 mg/L，孵育U14細胞48 h后顯示：與對照組相比，Taxol對U14細胞有明顯的抑制作用，α2，6-SA熒光強度減弱, Bax表達上調, Bcl-2表達下調, Bcl-2/Bax比值降低caspase 8和caspase 3活性增強；Taxol處理后U14細胞凋亡率(早期和晚期凋亡)增加；Taxol組U14細胞可見G0/G1期前出現顯著的Sub-G1期凋亡峰，G0/G1期細胞百分率減少，而S期和G2/M期細胞比率顯著增多，見圖2、表1。

Figure 2.Changes of α2,6-SA, Bcl-2 and Bax expression, caspase 8 and caspase 3 activity, apoptosis rate and cell cycle in U14 cells treated with 22.15 mg/L Taxol for 48 h were detected by flow cytometry.

圖2 流式細胞儀檢測對照組與Taxol組U14細胞的α2,6-SA、Bcl-2、 Bax、 caspase 8、caspase 3、細胞凋亡率和細胞周期的改變

3 ST6Gal1 和ST6Gal2 mRNA 的表達

U14細胞經 Taxol 10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L濃度分別處理48 h后，ST6Gal1 mRNA相對表達量隨著Taxol藥物濃度的遞增而遞減，呈顯著的劑量依賴性。而ST6Gal2 mRNA相對表達量均輕度上調，且有波動，以20 mg/L組上調較明顯，但與對照組相比，差異無統計學意義，見圖3。

討 論

紫杉醇是一種高效、作用強、廣譜的細胞周期特異性抗腫瘤藥物，能協同多種抗癌藥物，并增敏放療。Bava等[2]指出，MTT測定法評價紫杉醇藥物敏感性是非常方便的方法，100 nmol/L Taxol對人源性宮頸癌HeLa、SiHa、CaSki和ME-180細胞系具有高度的細胞毒性，而5 nmol/L和10 nmol/L Taxol誘導的細胞毒性分別為17%和50%。本研究中Taxol作用24 h對U14細胞的生長抑制作用欠佳，作用48 h和72 h則有一定的細胞毒性，呈現時間和一定劑量的依賴性，隨藥物濃度的遞增和時間的延長毒性作用增加, U14細胞的增殖存活逐漸受到抑制。

表1 流式細胞術分析Taxol處理48 h對U14細胞α2,6-SA、細胞凋亡相關因子和細胞周期的影響

Table 1.Effects of 22.15 mg/L Taxol treatment for 48 h on α2,6-SA, apoptosis-related factors and cell cycle in U14 cells were detected by flow cytometry (%. Mean±SEM.n=6)

ItemTaxolgroupControlgroupα2,6-SA11.25±0.65**43.70±1.28Bcl-212.71±1.82**56.24±3.79Bax29.67±5.07*9.77±1.39Caspase856.50±3.85**33.88±3.23Caspase315.73±2.37*4.72±0.83Apoptosisrate25.18±2.46*0.92±0.31Cellcycle Apoptosis(Sub-G1)12.56±0.45**6.46±0.31 G0/G1phase28.59±0.87**70.57±0.32 Sphase43.07±1.08**23.82±1.01 G2/Mphase28.34±1.64**5.41±1.50

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

細胞周期調控是一個復雜的生物學過程, 腫瘤的發生、發展與細胞周期密切相關，越來越多的研究顯示，腫瘤是一類細胞周期性紊亂性疾病[3]。細胞凋亡與腫瘤有著密切關系。腫瘤不僅是細胞增生過度，而且細胞死亡率過低，是增生與死亡失調所致，所以腫瘤不但是細胞增生異常的疾病，亦是死亡異常的疾病[4]，1979年，Schiff等[5]首次研究發現，紫杉醇抑制成倍增長的HeLa細胞的分裂，孵育20 h，HeLa細胞被阻止在G2/M期，阻滯細胞有絲分裂的完成。由此提出，紫杉醇抗腫瘤獨特機制是作用于細胞骨架蛋白微管系統，并可誘導腫瘤細胞的凋亡。Dang等[6]發現，紫杉醇孵育可增強HeLa細胞(HPV18陽性)和CaSki細胞(HPV16陽性)的凋亡(早期和晚期凋亡)，抑制癌細胞增殖。表明，紫杉醇是人類宮頸癌的廣譜有效藥物。Sreekanth等[7]利用3-甲基膽蒽(3-MC)制作小鼠宮頸多級鱗狀細胞癌模型，然后將腫瘤分離出的原代細胞，進行紫杉醇藥物處理，在10 nmol/L和25 nmol/L濃度下作用24 h，可見顯著的代表凋亡細胞群體的亞G1峰，G0/G1期細胞百分率減少，S期隨紫杉醇濃度的增加，呈現增加的趨勢，G2/M期百分率則明顯增多，提示紫杉醇誘導G2/M期阻滯。Bao等[8]觀察到HeLa細胞內及其表面顯示出較高的ST6Gal活性，且在G1期比S期有較大的ST6Gal活性，表明，在藥物治療中，對G1期HeLa細胞的ST6Gal活性的監控，可為ST6Gal相關抗癌藥物的開發和篩選提供一種有效的平臺。Baskaran等[9]發現，宮頸鱗狀細胞癌患者促凋亡蛋白Bcl-2表達增加，抗凋亡蛋白Bax表達減少， Bax蛋白與Bcl-2蛋白比例降低，caspase 3的活性顯著減弱，表明它們可能在宮頸癌細胞的異常增殖中發揮作用。本研究發現，Taxol作用后，U14細胞表面α2，6-SA熒光強度降低，Bcl-2表達減少，Bax表達增加，Bcl-2/Bax比值降低；caspase 8和caspase 3上調；細胞凋亡率增加；細胞周期檢測：G0/G1期前出現顯著的Sub-G1期凋亡峰，G0/G1期細胞顯著減少；而S期細胞和G2/M期細胞明顯增多，使較多U14細胞阻滯于 S期和G2/M期，提示Taxol可通過凋亡的細胞內線粒體途徑和細胞外死亡受體途徑引起caspase的級聯活化來誘導腫瘤細胞凋亡。Taxol下調α2，6-SA，伴隨細胞凋亡增加,表明Taxol可通過對U14細胞細胞周期和細胞凋亡調控的多重效應，殺傷癌細胞，從而抑制腫瘤細胞的增殖和生長。

Figure 3.The relative expression of ST6Gal1 mRNA and ST6Gal2 mRNA in U14 cells treated with different concentrations of Taxol for 48 h. Mean±SEM.n=9.*P<0.05vs0 mg/L.

圖3 qPCR 檢測ST6Gal1 mRNA和ST6Gal2 mRNA的相對表達量

癌細胞ST6Gal1的上調，催化癌細胞表面α2,6-唾液酸化，可促進腫瘤細胞的抗凋亡作用。本課題組發現，下調HeLa 細胞ST6Gal1的表達水平，可以降低宮頸癌 HeLa 細胞 α2,6-SA的表達，增強順鉑對 HeLa細胞的凋亡誘導效應[10]。增加ST6Gal1表達可介導整合素β1的α2,6-唾液酸化，保護結腸癌SW48細胞，阻斷細胞外分泌型Gal-3與整合素β1結合產生的促凋亡效應[11]。ST6Gal1可促進死亡受體Fas的α2，6-唾液酸化修飾，下調caspases 8和caspases 3的活化，抑制Fas誘導凋亡的能力，致腫瘤逃避凋亡[12]。強制下調ST6Gal1，可顯著增加TNF-α誘導的細胞凋亡[13]。以上可見， ST6Gal1是多種細胞存活途徑的一個關鍵調節因子，可作為一種潛在的抗細胞凋亡識別信號。

Mannherz等[14]通過TUNEL測定和流式細胞儀分析，首次確認ST6Gal2具誘導人HEK293T細胞凋亡功能。楊佳曄等[15]觀察到，轉染ST6Gal2的HeLa細胞，呈現大量的凋亡細胞。轉染ST6Gal2的HEK293T細胞，切割的caspase 3、caspase 7和PARP含量增加。轉染ST6Gal2的HEK293T細胞和內源性ST6Gal2蛋白水平顯著增加的小鼠大腦原代神經元中，分別檢測到內質網應激的標志蛋白BiP、Bim和CHOP含量增加，caspase 3增加，以上表明，ST6Gal2可引發內質網應激通道，導致細胞凋亡。證明，誘導細胞凋亡是ST6Gal2特有的性質。而轉染ST6Gal1的HEK293T細胞，BiP、Bim和CHOP的蛋白含量沒有增加，提示同屬一個家族的ST6Gal1不參與誘導細胞凋亡。本研究Taxol處理U14細胞，ST6Gal2 mRNA相對表達量均輕度上調，由于標準誤較大，未呈現顯著性差異，有待進一步研究。

本研究初步探討了Taxol抗宮頸癌U14細胞生長增殖和誘導凋亡作用的分子機制。首次報道了Taxol處理U14細胞，下調α2,6-SA和ST6Gal1表達。這些結果提示，α2,6-SA和ST6Gal可能參與Taxol對U14細胞細胞周期和凋亡調控的多重作用，為Taxol治療宮頸癌的機制補充了新的資料。

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(責任編輯： 陳妙玲, 羅 森)

Effects of Taxol on proliferation, apoptosis, and mRNA expression of α2,6-sialic acid and ST6Gal in cervical carcinoma cell line U14

GAO Xue-song, WANG Xiao-yu

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:twxy@jnu.edu.cn)

AIM: To study the effect of Taxol on the proliferation, apoptosis, and mRNA expressions of α2,6-sialic acid (SA) and α2，6-sialyltransferase (ST6Gal) in mouse cervical cancer cell line U14. METHODS: After the U14 cells were treated with Taxol, the IC50value of Taxol to U14 cells was detected by MTT assay. The expression of α2,6-SA and apoptosis-related factors (Bcl-2, Bax, caspase 8 and caspase 3), the apoptosis rate and cell cycle were determined by flow cytometry. The mRNA expression of ST6Gal1 and ST6Gal2 was detected by qPCR.RESULTS: As compared with control group, Taxol induced obvious U14 cell growth inhibition, reduced α2,6-SA expression, up-regulated Bax, down-regulated Bcl-2, decreased the ratio of Bcl-2/Bax, enhanced caspase 8 and caspase 3 activity, increased the apoptotic rate and cell proportions of Sub-G1and S phases, and induced G2/M phase arrest. Taxol also down-regulated the mRNA expression of ST6Gal1, and slightly up-regulated the mRNA expression of ST6Gal2. CONCLUSION: α2,6-SA and ST6Gal are involved in the multiple effects of Taxol on modulation of the cell cycle and apoptosis in U14 cells.

Taxol; Apoptosis; Cell cycle; α2,6-sialic acid; α2，6-sialyltransferase

1000- 4718(2017)06- 1038- 05

2016- 01- 21

2017- 03- 21

廣東省藥學會婦科腫瘤用藥研究基金資助項目(No. 2012D15)； 暨南大學第一臨床醫學院科研培育專項基金[2012]7號青年項目(No. 9)

R730.23； R711.74

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.013

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△通訊作者 Tel: 020-38688646; E-mail: twxy@jnu.edu.cn