p62在喉癌Hep-2細胞化療耐藥中的作用*

廖貴華， 黃文峰

(三峽大學中醫臨床醫學院， 宜昌市中醫醫院耳鼻咽喉頭頸外科， 湖北 宜昌 443003)

p62在喉癌Hep-2細胞化療耐藥中的作用*

廖貴華， 黃文峰△

(三峽大學中醫臨床醫學院， 宜昌市中醫醫院耳鼻咽喉頭頸外科， 湖北 宜昌 443003)

目的： 探討p62在喉癌細胞Hep-2 化療耐藥中的作用及潛在的作用機制。方法: 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)及Western blot法檢測喉癌耐藥細胞Hep-2/5-FU及其親本細胞Hep-2中p62的表達水平。在Hep-2/5-FU細胞中轉染p62 siRNA敲減p62的表達，采用CCK-8法和流式細胞術檢測細胞生存率及細胞凋亡狀態；檢測細胞中丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性來反映細胞氧化應激水平。Western blot檢測細胞凋亡相關調控因子Bcl-2、Bax、caspase-8/cleaved caspase-8、caspase-3/cleaved caspase-3的蛋白水平及抗氧化通路Keap1/Nrf2的活性。結果: 耐藥細胞株Hep-2/5-FU中p62的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于親本細胞株Hep-2；并且在親本細胞株Hep-2中，p62和Nrf2的蛋白表達水平隨著順鉑的濃度增加不斷升高。沉默p62可抑制喉癌耐藥細胞Hep-2/5-FU的生存，促進其凋亡，上調MDA的含量，降低SOD和GSH-Px的活性，同時上調Bax、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3和Keap1的蛋白水平，下調Bcl-2、Nrf2及HO-1的蛋白表達。結論: 喉癌耐藥細胞Hep-2/5-FU中沉默p62可恢復細胞對5-FU的敏感性，其機制可能與抑制Keap1/Nrf2信號通路的活化、調控細胞內氧化應激反應及細胞凋亡有關。

p62; 喉癌; 氧化應激; 細胞凋亡

喉癌是耳鼻喉頭頸外科的一種常見腫瘤，目前的治療依然以外科手術并應用化療藥物為主，但化療過程中出現的腫瘤耐藥性大大影響了治療效果，同時降低了患者術后生存率[1-3]。因而研究喉癌化療耐藥的相關機制，尋找耐藥基因對喉癌的個體化診療具有十分重要的意義。

p62是一種具有多個功能性結構域的多功能蛋白[4-5]。研究顯示，在包括胃癌[6]、睪丸癌[7]及非小細胞肺癌[8]等多種腫瘤中可檢測到p62的異常表達。細胞分子水平的研究進一步表明p62可通過復雜的信號通路網絡，參與調控細胞的增殖、分化及凋亡等病理生理過程[9-11]。此外，Lee 等[12]的研究顯示，肺癌耐藥患者癌組織中p62的表達顯著降低。但是關于p62在喉癌細胞化療耐藥中的作用研究甚少，本實驗擬通過轉染p62小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)，研究p62在喉癌細胞Hep-2化療耐藥中的作用，并進一步分析其潛在的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人喉癌細胞株Hep-2購于中國科學院上海細胞庫。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培養基和Opti-NEM培養基購于Gibco；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)購于Sigma；LipofectamineTM2000購于Invitrogen； 抗Bcl-2、Bax、caspase-8/cleaved caspase-8、caspase-3/cleaved caspase-3、Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)、核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)和血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1， HO-1)抗體購于Santa Cruz； CCK-8細胞活力分析試劑盒購于Dojindo；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基公司；p62 siRNA、陰性對照siRNA及SYBR Green I Real-Time PCR Kit由上海吉瑪制藥技術有限公司提供；其余試劑均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 細胞培養、轉染和分組 Hep-2細胞常規培養于含10% FBS的RPMI-1640培養基中。Hep-2/5-FU細胞為本實驗室前期所建立，為保持其耐藥性，需在其培養基中定期加用少量5-FU。培養條件為37 ℃、5% CO2恒溫培養箱。每隔1～2 d更換培養基1次。取對數生長期細胞消化并種植于6孔板中，待細胞融合至50%～60%左右，更換為無血清的培養基同步化12 h，轉染p62 siRNA或陰性對照siRNA。組別分為空白對照(control)組、陰性對照(negative control，Neg)組和p62 siRNA轉染組。將以上siRNA及LipofectamineTM2000分別溶解于Opti-MEM培養基中并孵育5 min，將兩者輕柔混合后室溫靜置20～30 min，形成復合體。將復合體分別加入6孔板中，培養箱中孵育6 h，更換為正常培養基繼續培養24 h，測定干擾效率并用于后續實驗分析。

2.2 CCK-8法測定細胞生存率 將各組細胞以每孔2×103個的密度接種于96孔板中，經相應處理后繼續培養，在培養時間截止前2 h加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h。用酶聯免疫檢測儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞的生存率。每組設3個復孔取均值，另設單孔只加入培養基不加入細胞作為空白對照。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 依據說明書要求，采用流式細胞術 Annexin V/PI 雙染色法檢測細胞凋亡。實驗步驟簡述如下：各組細胞消化后1 000×g離心5 min；加入binding buffer 重懸細胞。室溫避光的條件下，加入Annexin V-FITC混勻后靜置10 min；而后避光加PI染液，室溫下染色5 min，上機檢測，激發波長為488 nm，發射波長為530 nm。

2.4 MDA、SOD及GSH-Px的檢測 各組細胞經相應處理后， MDA、SOD及GSH-Px的檢測依據南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測說明書進行。

2.5 Western blot檢測蛋白水平 提取各組蛋白樣品并進行蛋白定量，調整各組上樣量(60 μg)并加入上樣緩沖液(體積比為1∶4)，98 ℃水浴變性5 min。采用8%的SDS-PAGE分離后將蛋白電轉至PVDF膜(約90 min)，加5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5 min×3次；再加入抗HRP標記的 II 抗，室溫孵育90 min，TBST洗滌10 min×3次。于暗室中將PVDF膜的蛋白面浸入HRP-ECL發光液中激發熒光，經壓片、顯影及定影后對蛋白條帶行灰度分析。

2.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測p62的mRNA水平 按照Trizol說明書提取各組細胞總RNA，純化后測定RNA樣品的A280 nm值并定量。取2 μg總RNA在逆轉錄酶的作用下逆轉錄至終體積為20 μL，而后采用SYBR Green I real-time PCR的方法檢測mRNA的相對表達。p62的正向引物為5’-GAACTCCAGTCCCTACAGAT-3’，反向引物為5’-CGATGTCATAGTTCTTG GTC-3’； GAPDH作為內參照，正向引物為5’-GGGTGATGCTGGTGCT GAGTATGT-3’，反向引物為5’-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3’。PCR反應體系為1 μL逆轉錄產物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix和100 nmol/L引物，調整總體積為25 μL。PCR反應條件為95 ℃ 5 min，然后進行40個循環(92 ℃ 10 s， 60 ℃ 50 s)。采用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對表達量。

3 統計學處理

所有實驗數據均錄入SPSS 13.0統計學分析軟件中進行統計學分析。實驗結果以均數±標準差(mean±SD)表示，多組數據采用單因素方差分析(ANOVA)，并用Bonferroni法進行均數組間的兩兩比較，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 p62的表達與喉癌細胞Hep-2化療耐藥之間的關系

我們首先檢測了5-FU對喉癌耐藥細胞株Hep-2/5-FU及其對照親本細胞株Hep-2的IC50[分別為(9.51±0.03) μmol/L和(0.42±0.02) μmol/L]，結果證明Hep-2/5-FU細胞對5-FU的耐藥性明顯增強。同時我們還檢測了這2株細胞p62的mRNA及蛋白表達情況。如圖1所示，耐藥細胞株Hep-2/5-FU中p62的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于親本細胞株；并且在親本細胞株Hep-2中，p62的蛋白表達水平隨著5-FU的濃度增加不斷升高。該結果提示p62的表達可能與Hep-2化療耐藥之間存在相關關系。

Figure 1.The relationship between p62 expression and drug resistance in human larygocarcinoma Hep-2 cells. A: the mRNA expression level of p62 in the Hep-2 cells and Hep-2/5-FU cells; B: the protein expression level of p62 in the Hep-2 cells and Hep-2/5-FU cells; C: the p62 and Nrf2 expression increased in a dose-dependent manner in the Hep-2 cells treated with 5-FU. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHep-2 group;#P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 p62的表達與Hep-2化療耐藥之間的關系

2 沉默p62對耐藥細胞株Hep-2/5-FU化療敏感性的影響

為進一步證明p62的表達與喉癌化療耐藥之間的相互關系，我們在耐藥細胞株Hep-2/5-FU中沉默p62，并檢測細胞對5-FU敏感性的變化。CCK-8實驗的結果顯示，在Hep-2/5-FU細胞中沉默p62后，細胞對5-FU的敏感性明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Knockdown ofp62 increased the sensitivity of Hep-2/5-FU cells to 5-FU exposure. A: the efficacy ofp62 siRNA transfection; B: knockdown ofp62 increased the sensitivity of Hep-2/5-FU cells to 5-FU exposure. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2 沉默p62可提高耐藥細胞Hep-2/5-FU對5-FU的敏感性

3 沉默p62對Hep-2/5-FU細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，沉默p62可致耐藥細胞Hep-2/5-FU的凋亡率明顯增加(P<0.05)。除此之外，我們還檢測了凋亡相關蛋白的表達情況，結果顯示在Hep-2/5-FU細胞中敲減p62之后Bcl-2的表達降低，而Bax、cleaved caspase-8和cleaved caspase-3的蛋白水平增加(P<0.05)，見圖3。這提示沉默p62可影響凋亡相關蛋白的表達并促進細胞凋亡。

4 沉默p62對Hep-2/5-FU細胞氧化應激反應的影響

結果如圖4所示，在Hep-2/5-FU細胞中沉默p62，可致MDA的含量增加，同時SOD及GSH-Px的活性顯著降低，差異有統計學意義。結果說明沉默p62可提高細胞內氧化應激水平。

5 沉默p62對Hep-2/5-FU細胞 Keap1/Nrf2信號通路的影響

Western blot 的結果顯示(圖1)，在親本細胞株Hep-2中，Nrf2的蛋白表達水平隨著5-FU的濃度增加不斷升高，提示Nrf2可能參與影響Hep-2/5-FU細胞的化療耐藥。為進一步研究Keap1/Nrf2信號通路與p62調控化療耐藥之間的關系，我們檢測了沉默p62后Hep-2/5-FU細胞中Keap1/Nrf2信號通路的活性。如圖5所示，沉默p62后，Keap1的蛋白表達水平明顯升高，而Nrf2及HO-1蛋白的表達水平顯著降低。結果提示沉默p62可抑制Keap1/Nrf2信號通路的激活。

討 論

腫瘤細胞化療耐藥性的出現是影響治療效果及患者預后和生存率的重要原因之一，既往的研究讓我們對腫瘤化療耐藥性的認識愈加深入，一般可將其概括為藥物代謝動力學的改變、腫瘤細胞及腫瘤微環境的改變等方面[13-14]。自噬因其在清除受損蛋白，促進細胞生存中發揮重要的作用而備受研究者的關注。大量的研究均表明自噬是多種分子調控化療耐藥的作用途徑[15-16]。本研究選擇p62作為靶點，系統分析了其在喉癌細胞Hep-2化療耐藥中的作用。研究結果發現，在喉癌5-FU耐藥細胞株中p62 mRNA和蛋白的表達水平均顯著增加，且親本細胞株Hep-2中p62的表達與5-FU 之間存在劑量依賴的關系，提示p62可能參與調控喉癌Hep-2細胞5-FU耐藥現象的發生。通過轉染p62 siRNA，我們發現在喉癌5-FU耐藥細胞株Hep-2/5-FU中沉默p62可提高細胞對5-FU的敏感性。因此我們認為，沉默p62可逆轉喉癌5-FU耐藥。

Figure 3.The effect ofp62 knockdown on the apoptosis of the Hep-2/5-FU cells. A: the cell apoptotic rate detected by flow cytometry; B: the effect ofp62 knockdown on the expression of apoptosis-related proteins detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3 沉默p62對Hep-2/5-FU細胞凋亡的影響

Figure 4.The effect ofp62 knockdown on the cell oxidative stress. A: the changes of MDA contents; B: the changes of SOD activity; C: the changes of GSH-Px activity. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖4 沉默p62對Hep-2/5-FU細胞氧化應激水平的影響

細胞的凋亡抵抗作用是多種腫瘤細胞化療耐藥的重要機制，為進一步了解沉默p62逆轉喉癌5-FU耐藥的作用機制，我們檢測了耐藥細胞Hep-2/5-FU沉默p62后，細胞的凋亡水平。結果顯示，沉默p62可致耐藥細胞Hep-2/5-FU的凋亡率明顯增加，同時影響凋亡相關Bcl-2和Bax蛋白并激活caspase-8及其下游的效應蛋白caspase-3，從而誘導細胞凋亡。這提示，沉默p62可通過誘導細胞凋亡來逆轉喉癌5-FU耐藥。作為程序性細胞死亡的2種不同形式，自噬與凋亡之間既有聯系又有區別，且兩者之間的轉化關系目前并不清晰，而內質網和氧化應激可能涉及到兩種作用的整合[17]。研究顯示多種損傷性刺激打破細胞內氧化應激的平衡狀態是誘導細胞凋亡的一條重要途徑[18]。p62是一種重要的選擇性自噬接頭蛋白，可參與清除泛素化蛋白；同時p62/SQSTM1和泛素化修飾是調控氧化應激損傷的關鍵分子[19]，而這種氧化應激水平的改變又可影響腫瘤的化療耐藥[20]。故而我們檢測了p62對喉癌耐藥細胞Hep-2/5-FU氧化應激反應的影響，結果發現，沉默p62可提高細胞內氧化應激水平。提示沉默p62可引發細胞氧化應激損傷，并進一步導致細胞的死亡，這可能是p62調控Hep-2/5-FU化療耐藥的一種方式。

Figure 5.The effect ofp62 knockdown on the expression of Keap1/Nrf2 pathway-related proteins in the Hep-2/5-FU cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖5 沉默p62對Hep-2/5-FU細胞keap1/Nrf2信號通路相關蛋白表達的影響

Keap1/Nrf2信號通路是近年來發現的抵抗氧化等刺激的重要防御性信號通路； p62則是Keap1-Nrf2的一個重要調控因子，可通過結合Keap1阻斷Keap1對Nrf2的調控，進而導致Nrf2的持續活化，上調下游的抗氧化基因如HO-1等的表達，降低胞內ROS的水平，促進癌細胞生長并參與癌細胞化療耐藥[21-22]。我們的檢測結果發現，沉默p62可抑制Keap1/Nrf2信號通路的激活，提示沉默p62逆轉喉癌5-FU耐藥可能與Keap1/Nrf2信號通路有關，但是否還有其它通路的參與及其具體的調控機制還有待進一步的研究。

綜上所述，喉癌耐藥細胞Hep-2/5-FU中沉默p62可恢復細胞對5-FU的敏感性，其機制可能與抑制Keap1/Nrf2信號通路的活化，調控細胞內氧化應激反應及細胞凋亡有關。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of p62 on drug resistance of human laryngocarcinoma cell line Hep-2

LIAO Gui-hua, HUANG Wen-feng

(DepartmentofENT&HNSurgery,YichangHospitalofTCM,CollegeofClinicalMedicineofTCM，ChinaThreeGorgesUniversity，Yichang443003,China.E-mail:hwfhuangwenfeng@126.com)

AIM: To investigate the effects of p62 on drug resistance of human laryngocarcinoma cell line Hep-2. METHODS: The abundance of p62 in Hep-2/5-FU and Hep-2 cells was measured by RT-qPCR and Western blot. After silencing ofp62 withp62 siRNA in the Hep-2/5-FU cells, the cell viability and cell apoptosis were determined by CCK-8 assay and flow cytometry. The levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured to reflect the status of oxidative stress in the cells. The protein levels of apoptosis-related molecules Bcl-2, Bax, caspase-8/cleaved caspase-8 and caspase-3/cleaved caspase-3， and the activity of anti-oxidative stress pathway-related proteins Keap1/Nrf2 were measured by Western blot. RESULTS: The expression of p62 at both mRNA and protein levels was significantly up-regulated in the Hep-2/5-FU cells. The expression of p62 and Nrf2 increased in a dose-dependent manner in the Hep-2 cells. Knockdown ofp62 inhibited the viability and promoted the apoptosis of the Hep-2/5-FU cells. Increased content of MDA, and suppressed activity of SOD and GSH-Px were also observed. Furthermore, knockdown ofp62 up-regulated the protein levels of Bax, cleaved caspase-8, cleaved caspase-3 and Keap1, but down-regulated the protein levels of Bcl-2, Nrf2 and HO-1. CONCLUSION: Knockdown ofp62 increases the sensitivity of Hep-2/5-FU cells to 5-FU exposure. The mechanism may be related to the inhibition of Keap1/Nrf2 pathway and the modulation of oxidative stress and cell apoptosis.

p62; Laryngeal neoplasms; Oxidative stress; Apoptosis

1000- 4718(2017)06- 1031- 07

2016- 12- 06

2017- 03- 28

宜昌市大學科學研究與計劃項目(No. A201230234)

R739.65； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.012

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