bFGF和MMP9在鼻咽癌組織中的表達及其臨床意義*

趙建夫， 陳文慧， 趙鳳芝， 全 強， 樊 晶， 陳碧云， 張 鼎， 徐 萌

(暨南大學附屬第一醫院腫瘤科， 廣東 廣州 510632)

bFGF和MMP9在鼻咽癌組織中的表達及其臨床意義*

趙建夫， 陳文慧， 趙鳳芝， 全 強， 樊 晶， 陳碧云， 張 鼎， 徐 萌△

(暨南大學附屬第一醫院腫瘤科， 廣東 廣州 510632)

目的： 探討堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和基質金屬蛋白酶9(MMP9)在鼻咽癌患者中的表達及其臨床意義。方法: 應用免疫組化方法檢測289例鼻咽癌患者活檢組織治療前bFGF和MMP9的表達水平，并分析二者與鼻咽癌患者臨床病理特征和預后的關系。結果: 289例鼻咽癌組織bFGF和MMP9陽性表達率分別為71.3%和61.6%；bFGF和MMP9的陽性表達與鼻咽癌的N分期和臨床分期有顯著的相關性(P<0.05)，且兩者的高表達均與鼻咽癌的不良預后顯著相關(P<0.01)；在鼻咽癌組織中Spearman相關分析發現，bFGF的表達與MMP9的表達呈明顯正相關(r=0.634，P<0.05)；亞組分析表明，bFGF和MMP9表達水平均升高的鼻咽癌患者的預后最差。結論: bFGF和MMP9在鼻咽癌組織中的表達升高，且兩者與鼻咽癌的不良預后明顯相關，聯合應用有可能成為鼻咽癌的診斷、治療及判斷預后的生物標志物。

鼻咽癌； 堿性成纖維細胞生長因子； 基質金屬蛋白酶9； 預后； 生物標志物

鼻咽癌是我國華南地區常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度較高，早期即可出現淋巴結轉移[1-2]。放射治療是鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)最主要的治療手段，隨著影像學水平和放療技術的提高，鼻咽癌的局部區域控制率得到明顯的提高[3]，但遠處轉移率仍居高不下。因此，尋找鼻咽癌發生發展的重要靶向標志物，對腫瘤精準治療及預后判斷等具有重要的指導意義。

基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)為鋅離子依賴性內肽酶超家族，其主要生理功能是降解細胞外基質的有效成分、參與調節細胞黏附、胚胎發育、組織再塑及創傷修復等[4-5]。MMP9是基質金屬蛋白酶家族中重要的IV型膠原酶，在多種腫瘤中表達升高，并能通過促進腫瘤新生血管生成、細胞黏附等影響惡性腫瘤的增殖、遷移和侵襲[6-9]。堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是具有促進細胞有絲分裂和誘導新血管生成作用的多肽，在腫瘤侵襲和轉移中均扮演重要角色[10-12]。因此，bFGF和MMP9在腫瘤侵襲轉移中均扮演重要角色。目前國內外有關鼻咽癌發病和預后的相關研究越來越多，但是bFGF和MMP9兩者聯合應用在國內外鮮見報道。本研究通過檢測鼻咽癌患者治療前活檢組織中bFGF和MMP9的表達情況，探討兩者與鼻咽癌的關系及在鼻咽癌發生發展中的作用，為鼻咽癌的診斷、治療以及判斷預后提供新思路和理論依據。

材 料 和 方 法

1 一般資料

搜集2005年1月～2008年12月在廣州市暨南大學附屬第一醫院初治未發生遠處轉移的鼻咽癌患者組織標本289例，治療前均通過鼻咽組織活檢病理證實為非角化性鼻咽癌，所有鼻咽癌患者均于我院住院完成全程常規標準治療，均有完整的臨床及隨訪資料，排除如嚴重心、肝、腎疾病、血栓性疾病以及1個月內有手術史、創傷史及合并嚴重感染的患者。其中男性227例，女性62例；年齡18～77歲，中位年齡46歲。所有患者根據第七版美國癌癥聯合委員會/國際抗癌聯盟(AJCC/UICC)的鼻咽癌TNM分期標準重新評定臨床分期。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

2 主要試劑

免抗人多克隆抗體 MMP9、兔抗人單克隆抗體bFGF均購自Abcam；免疫組織化學染色 SP 試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。

3 免疫組化檢測方法

所有標本均經4%中性甲醛固定，常規石蠟包埋。石蠟切片厚4 μm，并脫蠟、水化。具體方法按根據免疫組織化學染色SP試劑盒說明書進行操作，檢測鼻咽癌組織中bFGF和MMP9蛋白的表達，PBS作為I抗的陰性對照。

4 結果評定

染色結果顯示bFGF和MMP9均主要表達在鼻咽組織的細胞膜及細胞漿。選取5個高倍(×400)視野，每視野計數100個細胞，取其平均數，病理結果至少由兩位獨立的病理醫生在不知病例資料的情況下完成。將免疫染色強度分為陰性(0分)、弱陽性(1分)、中度陽性(2分)和強陽性(3分)；染色范圍百分比分為： < 25% (1 分)， 26%～50% (2 分)， 51%～75% (3 分)，> 75% (4分)。按照染色強度及陽性細胞數占腫瘤細胞的百分比綜合計分：把染色強度得分與陽性細胞數得分相乘選擇，0～4分判斷為陰性，5～12分判斷為陽性。

5 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理。采用Pearson chi-square test或Fisher’s exact test分析bFGF或MMP9的表達與臨床資料(包括患者的年齡、性別、腫瘤分級、TNM 分期及臨床分期)之間的聯系；兩組率的比較采用卡方檢驗；應用Spearman等級相關進行bFGF和MMP9表達的相關性分析；采用Kaplan-Meier法分析bFGF或MMP9的表達與預后的關系；采用log-rank檢驗對不同生存曲線進行比較；t檢驗或Mann-Whitney檢驗用于兩組獨立樣本之間的比較分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 bFGF和MMP-9的表達與鼻咽癌各臨床特征的關系

290例鼻咽癌患者的臨床特征見表1，患者的中位隨訪時間為69個月(四分位數間距為62～73 月)，37例患者出現局部區域復發，47例患者發生遠處轉移，其中有6例患者同時出現有局部區域復發和遠處轉移，死亡患者54例。bFGF和MMP9染色均主要為細胞漿陽性，分布于腫瘤細胞的細胞漿呈棕黃色顆粒，見圖1。

檢測bFGF水平結果顯示，289例鼻咽癌組織bFGF陽性表達率為71.3%，且bFGF蛋白的高表達與鼻咽癌的N分期和臨床分期有顯著的相關性(P<0.05)。另外， bFGF蛋白的表達與其它臨床病理特征(包括年齡、性別、病理分級和T分期)沒有明顯的相關性，見表1。

檢測MMP9水平結果顯示，289例鼻咽癌組織MMP9陽性表達率分別為61.6%。MMP9蛋白的高表達與鼻咽癌的N分期和臨床分期有顯著的相關性(P<0.05)。另外， MMP9蛋白的表達與其它臨床病理特征(包括年齡、性別、病理分級和T分期)沒有明顯的相關性，見表1。

*Chi-square test.

Figure 1.Expression of bFGF and MMP9 proteins in NPC tissues detected by immunohistochemical staining (×40 ).

圖1 免疫組化染色檢測bFGF和MMP9在鼻咽癌組織及癌旁正常鼻咽黏膜上皮組織中的表達

Spearman相關分析發現，bFGF的表達與MMP9的表達呈明顯正相關(r=0.634,P<0.01)。

2 bFGF和MMP9在鼻咽癌組織中的表達與鼻咽癌患者預后密切相關

分析 bFGF和MMP9蛋白表達上調與鼻咽癌患者預后的關系，根據Kaplan-Meier生存分析制作生存曲線，用log-rank檢驗比較鼻咽癌患者存活時間的差異，結果見圖2。bFGF和MMP9表達水平上調的鼻咽癌患者其疾病無進展生存率(progression-free survival, PFS)和總生存率(overall survival, OS) 明顯短于那些表達水平低的患者(P<0.01)。

3 bFGF和MMP9聯合表達與鼻咽癌預后的相關性

前面相關分析發現，bFGF表達水平和MMP9表達水平在鼻咽癌患者中均升高，且bFGF的表達與MMP9的表達呈明顯的正相關，進一步分析發現bFGF和MMP9兩者表達都上調的鼻咽癌患者比bFGF和(或)MMP9兩者表達較低的鼻咽癌患者預后差。結果顯示，bFGF和MMP-2在鼻咽癌組織中的表達升高，且與鼻咽癌患者預后差密切相關，見圖2。

Figure 2.Kaplan-Meier curves of progression-free survival (A, C, E) and overall survival (B, D, F) in nasopharyngeal carcinoma patients with different expression levels of bFGF (A, B), MMP9 (C, D) and both (E, F).

圖2 鼻咽癌組織中 bFGF和 MMP9 的表達及與鼻咽癌預后的關系

討 論

鼻咽癌發病具有明顯的地域性，以我國華南地區發病率最高，尤其是我國的廣西、 廣東、 福建等地高發，發病率可達 33/10 萬，鼻咽癌又被稱為“廣東瘤”[13-14]。近年來鼻咽癌的治療方案不斷改善，但患者總體5年生存率仍不理想，主要原因是腫瘤出現局部復發或/和遠處轉移，其最常見的轉移部位是骨、肝和肺[1, 15]。因而尋找腫瘤侵襲和轉移的特異性標志物將有助于判斷鼻咽癌患者的預后，并對有復發傾向的患者采取更有效的治療措施，以提高患者生存率。

近年研究表明，血管形成在腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移中發揮著重要作用，已成為腫瘤治療的新靶點之一[16]。bFGF是目前已知最重要的血管新生正調控因子之一，在多種惡性腫瘤疾病中表達升高，可反映微血管增生程度[17]。bFGF是內皮細胞生長促進作用效果最強的因子之一，主要機制是bFGF調節細胞外分子，包括膠原酶、蛋白激酶、整合素等的活性，促進腫瘤中新生血管形成，從而促進腫瘤細胞浸潤和轉移[18]。Dietz等[19]研究發現放化療對頭頸癌患者的療效與血清中bFGF的濃度密切相關，血清中bFGF的濃度越低，療效越好。葉奕菁等[20]認為bFGF在鼻咽癌組織中有高表達,參與了鼻咽癌發生發展、侵襲轉移等生物學行為。趙建夫等[21]發現bFGF在鼻咽癌組織中的表達升高，且與腫瘤的放療敏感性明顯相關，可作為預測鼻咽癌放療敏感性的重要指標。Yang等[22]檢測正常人和腫瘤患者尿液和血清中的bFGF濃度的差異進一步證明腫瘤血管增殖與bFGF蛋白的表達有密切關系，并指出bFGF蛋白表達是診斷血管瘤的蛋白標志物。我們收集了 289例鼻咽癌活檢組織標本，免疫組化結果發現，在鼻咽癌組織中bFGF蛋白表達明顯增高，且與鼻咽癌的N分期和臨床分期有顯著的相關性，提示在鼻咽癌中bFGF高表達可能與腫瘤惡性進展的程度密切相關。根據Kaplan-Meier生存曲線分析，結果顯示bFGF高表達與鼻咽癌不良預后密切相關。

MMPs是一組結構和功能相關的鋅依賴性內肽酶，是能降解細胞外基質的蛋白酶，其高表達與人類腫瘤的轉移潛能增加有關。MMP9是MMPs家族中最重要的一員，與腫瘤的高侵襲性相關[23-24]。Cheng等[25]研究發現MMP9表達水平上調的鼻咽癌患者無病生存率和總生存率明顯低于那些表達水平低的患者。

本研究結果示，在鼻咽癌組織中MMP9蛋白表達明顯增高，且與鼻咽癌的N分期和臨床分期有顯著的相關性，提示在鼻咽癌中MMP9高表達可能與腫瘤惡性進展的程度密切相關。預后分析評估結果顯示，MMP9高表達與鼻咽癌不良預后密切相關。

腫瘤轉移和/或擴散不僅需要新生血管，也需要降解細胞外基質(extracellular matrix, ECM)蛋白。Mohan等[26]發現，MMP9是bFGF介導血管生成通路的下游靶基因，bFGF通過活化AP-1調節MMP9表達，并通過姜黃素抑制MMP9的啟動子活性而阻斷bFGF介導的血管生成及MMP9表達，提示bFGF和MMP9在血管生成過程中的相關性。在鼻咽癌組織中Spearman相關分析發現，bFGF的表達與MMP9的表達呈明顯正相關。進一步分析發現bFGF和MMP9兩者表達都上調的鼻咽癌患者比bFGF和(或)MMP9兩者表達下降的鼻咽癌患者預后最差。結果顯示，bFGF和MMP-2在鼻咽癌組織中的表達升高，且與鼻咽癌患者預后差密切相關。

綜上所述，bFGF和MMP9在鼻咽癌組織中表達升高，且與鼻咽癌的不良預后顯著相關。鼻咽癌患者治療前bFGF和MMP9的表達水平可能成為鼻咽癌精準治療新的潛在的治療靶點及預后判斷等提供新的依據。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression and clinical significance of bFGF and MMP9 in nasopharyn-geal carcinoma

ZHAO Jian-fu, CHEN Wen-hui, ZHAO Feng-zhi, QUAN Qiang, FAN Jing, CHEN Bi-yun, ZHANG Ding, XU Meng

(TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xumengjinan@yahoo.com)

AIM: To detect the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) and matrix metalloprotei-nase 9 (MMP9) in nasopharyngeal carcinoma (NPC) and its correlation with clinicopathological features and prognosis of the patients. METHODS: The expression of bFGF and MMP9 was detected by the method of SP immunohistochemical staining in biopsy tissues of NPC patients. The relationship between the expression and the clinical significance was analyzed as well. RESULTS: In 289 cases of NPC patients, the positive rates of bFGF and MMP9 were 71.3% and 61.6%, respectively. Correlation analysis demonstrated that the expression rates of bFGF and MMP9 were both positively associated with N stage and clinical stage in NPC patients. The high expression rates of both bFGF and MMP9 were associated with poor overall survival and progression-free survival of NPC patients. Furthermore, the positive rate of bFGF was positively correlated with that of MMP9, and over-expression of both bFGF and MMP9 was correlated with the poorest survival outcomes in NPC patients. CONCLUSION: bFGF and MMP9 are over-expressed in NPC tissues and significantly associated with NPC recurrence and poor outcome. The combined interpretation of bFGF and MMP9 expression levels leads to refinement of the risks for the NPC patients and could be chosen as the prognostic biomarkers.

Nasopharyngeal carcinoma; Basic fibroblast growth factor; Matrix metalloproteinase 9; Prognosis; Biomarkers

1000- 4718(2017)06- 1006- 06

2016- 12- 29

2017- 04- 10

國家自然科學基金資助項目(No. 81273814)； 廣東省重大新藥創制重大科技專項資助(No. 2013A022100031); 暨南大學附屬第一醫院科研培育項目

R730.23; R739.63

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.008

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