6-羥多巴損傷黑質導致弓狀核離子鈣接頭蛋白1和阿片-促黑素皮質素原表達的變化*

張毅敏， 連 輝， 宋海巖， 周 立， 蔡君艷， 王志勇△

(1 新鄉醫學院河南省醫用組織再生重點實驗室， 河南 新鄉 453003； 2東南大學附屬中大醫院， 江蘇 南京 210009)

6-羥多巴損傷黑質導致弓狀核離子鈣接頭蛋白1和阿片-促黑素皮質素原表達的變化*

張毅敏1， 連 輝1， 宋海巖1， 周 立1， 蔡君艷2， 王志勇1△

(1新鄉醫學院河南省醫用組織再生重點實驗室， 河南 新鄉 453003；2東南大學附屬中大醫院， 江蘇 南京 210009)

目的： 觀察6-羥多巴(6-OHDA)損傷大鼠黑質(SN)后下丘腦弓狀核(Arc)中酪氨酸羥化酶(TH)、離子鈣接頭蛋白1(Iba1)和阿片-促黑素皮質素原(POMC)的表達變化，為帕金森病(PD)患者消瘦的發生機制提供線索。方法: 20只SD大鼠隨機分為6-OHDA大鼠組(雙側SN內注射6-OHDA)和對照組(注射等體積生理鹽水)。免疫熒光染色和Western blot檢測SN內TH，以及Arc內TH、Iba1和POMC的表達。結果: 與對照組比較，6-OHDA大鼠組體重無明顯變化，但腹膜后脂肪重量從(7.550±0.670) g減少到(3.895±0.465) g (P<0.01)。SN內TH陽性細胞數量從56±5減少至14±2 (P<0.05)；蛋白表達水平從0.75±0.11降低至0.41±0.09 (P<0.01)。Arc中TH陽性細胞數量從21±2減少到10±3 (P<0.05)；Iba1陽性細胞數量從12±2增加到30±5 (P<0.05)；POMC陽性細胞數量從16±4增加到31±2 (P<0.05)。下丘腦內TH蛋白的表達水平從0.35±0.05降低到0.21±0.02 (P<0.01)；Iba1蛋白的表達水平從0.23±0.06增加至0.51±0.04 (P<0.01)；POMC的蛋白表達水平從0.37±0.05 增加至0.65±0.03 (P<0.01)。結論: Arc中TH、Iba1和POMC表達變化可能與PD脂肪減少存在一定的聯系。

6-羥多巴； 弓狀核； 酪氨酸羥化酶； 離子鈣接頭蛋白1； 阿片-促黑素皮質素原

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種以黑質(substantia nigra，SN)中多巴胺能神經元損傷為特征的神經退行性疾病[1-2]，體重減輕是PD病人常見的非運動功能障礙之一，PD病人體重減輕原因為體脂的減少[3]。弓狀核(arcuate nucleus，Arc)是間腦內調控能量代謝的重要神經核團，也是接受外周調節代謝相關激素濃度變化信號的第一級感受神經核團[4]。Arc中，阿片-促黑素皮質素原(pro-opiomelanocortin，POMC)廣泛分布，是調控外周脂肪分解、產熱以及攝食的重要遞質。研究證明，Arc的POMC能神經元受到多巴胺的直接調控，這一調控作用通過多巴胺受體(dopamine receptor，DR)實現[5]。同時，中樞免疫系統也參與了調節機體能量代謝，最近的研究發現，肥胖小鼠模型中，小膠質細胞損傷并吞噬Arc的POMC能神經元，是小鼠模型肥胖發生的機制之一[6-7]。本研究的目的是利用6-羥多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損傷大鼠雙側黑質的PD模型，觀察Arc中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、POMC以及膠質細胞標志蛋白離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)的變化，以期為PD病人消瘦發生機制提供線索。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

成年健康SD品系雌性大鼠20只，體重220～250 g(新鄉醫學院實驗動物中心提供)。大鼠每籠4只喂養，室溫24 ℃，濕度45%。3 d后根據隨機數字表分為對照組與6-OHDA組(n=10)，6-OHDA組大鼠分別在雙側SN內注射2 μL 6-OHDA，其中5只做免疫熒光染色，5只做Western blot檢測。

2 方法

2.1 6-OHDA大鼠模型的制備和鑒定 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，剪去頭皮上部毛發，在常規消毒下，于頭顱正中切開頭皮和皮下組織，確定前囟坐標，參照大鼠腦立體定位圖譜，確定兩側SN坐標：前囟尾側4.4 mm，矢狀縫兩側1.2 mm，硬膜下7.8 mm。進行標記定位后，牙科鉆在相應部位鉆透顱骨，勿損傷硬腦膜。用10 μL Hamilton微量進樣器吸取6-OHDA 4 μL (4 g/L)，每孔2 μL，緩慢進針至預定深度，1 μL/min 注入，注射完畢留針5 min后，1 mm/min緩慢退出，縫合皮膚。對照組大鼠用同樣的方法在兩側SN給予等體積的生理鹽水。術后前3 d每只大鼠腹腔注射青霉素鈉2.0×105U，以預防感染。術后6周2組大鼠分別以轉棒實驗進行行為學檢測。

兩組大鼠在術后的第1個月每天稱量體重，之后每周稱量1次。6-OHDA注射雙側黑質6 周后，稱量兩組的攝食量。每只大鼠都飼養在一個獨立的、干凈的鼠籠中觀察24 h，并記錄攝食量。

2.2 SN和Arc的Nissl染色 6 周后，分別取2組大鼠各5只，依次用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌流固定，取大腦，在同種固定液中后固定24 h，然后依次用15%和30%的蔗糖溶液梯度脫水48 h，-80 ℃冰箱中放置30 min后，根據大鼠腦圖譜確定SN和Arc的位置，做冰凍連續冠狀切片，片厚20 μm。切片入蒸餾水洗滌2 min，Nissl染液染3 min，蒸餾水洗滌1 min后，依次脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察Arc中的Nissl小體。

2.3 SN和Arc的免疫熒光染色 切片經微波抗原修復15 min，5%的山羊血清封閉30 min，SN處滴加TH小鼠單克隆抗體(1∶5 000; Sigma)，Arc處分別滴加TH小鼠單克隆抗體、Iba1兔多克隆抗體(1∶200； WAKO)和POMC小鼠多克隆抗體(1∶50； Abcam)，4 ℃孵育過夜后，SN處滴加Alexa Fluro 488標記山羊抗小鼠IgG(1∶500，碧云天生物技術有限公司)；Arc處滴加Alexa Fluro 488標記山羊抗小鼠IgG和Cy3標記山羊抗兔IgG(1∶500，碧云天生物技術有限公司)等體積的混合液，室溫反應1 h，抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察SN中TH，以及Arc中TH、Iba1與POMC的共表達，計數每個視野中陽性細胞的數量。

2.4 Western blot檢測SN中TH和下丘腦中的TH、Iba1及POMC的表達 按上述方法麻醉其余大鼠，冰上直接斷頭快速地取出大鼠SN以及下丘腦的腦組織。常規提取組織中蛋白質，BCA法檢測蛋白濃度。2組蛋白各取樣40 μg進行SDS-PAGE，電轉移至NC膜，裁剪目的條帶。5%的脫脂奶粉封閉1 h，SN的條帶上加TH小鼠單克隆抗體(1∶10 000； Sigma)，下丘腦的相應條帶分別加TH小鼠單克隆抗體(1∶10 000)、Iba1兔多克隆抗體(1∶500； WAKO)和POMC小鼠多克隆抗體(1∶200； Abcam)，4 ℃過夜；HRP標記的山羊抗小鼠IgG (1∶1 000； 碧云天生物技術有限公司)孵育TH和POMC 1 h，HRP標記的山羊抗兔IgG (1∶1 000； 碧云天生物技術有限公司)孵育Iba1 1 h，ECL顯色。應用Fluorchem 2.0系統進行光密度測定，以目的條帶與內參照GAPDH的平均光密度的比值表示蛋白水平，進行分析。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism軟件進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間數據統計分析使用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 6-OHDA大鼠組SN的病變特點

TH是兒茶酚胺合成過程中的限速酶，SN中TH陽性神經元大多是多巴胺能的，因此TH可以看做是SN中多巴胺能神經元的標志。將6-OHDA注入SN 6周后，與對照組相比較，免疫熒光染色可見6-OHDA大鼠組SN中每個視野(×200)的TH陽性神經元數量從56±5減少至14±2 (P<0.05),見圖1； Western blot分析可見SN中TH的蛋白表達水平從0.75±0.11降低至0.41±0.09 (P<0.01)，見圖2；行為學檢測觀察到6-OHDA組大鼠在轉棒上停留的時間從(85.7±6.3) s縮短到(44.9±11.1) s (P<0.01)，見圖3。上述結果說明造模成功。

Figure 1.The immunoreactivity of tyrosine hydroxylase (TH) in the substantia nigra (SN) of control and 6-OHDA rats.

圖1 2組大鼠SN中TH免疫熒光染色結果

對2組大鼠的體重和攝食量觀察可見，6-OHDA大鼠的體重略低于對照組，但差異未見統計學顯著性，同時攝食量的差異也無統計學顯著性。但是，腹膜后脂肪含量從(7.550±0.670) g減少到(3.895±0.465) g，差異有統計學顯著性(P<0.01)，見圖4。

Figure 2.The protein expression of tyrosine hydroxylase (TH) in the substantia nigra (SN) of control and 6-OHDA rats detected by Western blot. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖2 Western blot檢測2組大鼠SN中TH蛋白的表達

Figure 3.The time spent on the rotarod in control and 6-OHDA rats. Mean±SD.n=10.**P<0.01vscontrol group.

圖3 2組大鼠在轉棒上停留時間的比較

2 Arc中TH、Iba1和POMC陽性神經元的分布

尼氏染色可見，6-OHDA大鼠組與對照組之間的神經元無明顯變化。免疫熒光染色可見，TH分布于神經元的細胞體和突起；POMC分布于神經元的細胞體，且在POMC陽性的神經元周圍有大量Iba1陽性細胞表達。與對照組相比較，6-OHDA組Arc中每個視野(×200) TH陽性的神經元和纖維密度明顯減少，同時Iba1陽性的細胞數量從12±2增加到30±5(P<0.05)，POMC陽性的神經元數量從16±4增加到31±2 (P<0.05)，見圖5、6。

3 下丘腦TH、Iba1和POMC蛋白水平的變化

6-OHDA注入SN 6周后，下丘腦TH的蛋白表達水平從0.35±0.05降低到0.21±0.02 (P<0.01)，Iba1的蛋白表達水平從0.23±0.06 增加至0.51±0.04 (P<0.01)，POMC的蛋白表達水平從0.37±0.05增加至0.65±0.03 (P<0.01)，見圖7。

Figure 4.The body mass (A), food consumption (B) and retroperitoneal fat weight (C) in control and 6-OHDA rats. Mean±SD.n=5～10.**P<0.01vscontrol group.

圖4 兩組大鼠體重、攝食量以及腹膜后脂肪重量比較

Figure 5.Nissl staining (A) and the tyrosine hydroxylase (TH) immunoreactivity (B) in the arcuate nucleus (Arc) of control and 6-OHDA rats (×200).

圖5 2組大鼠Arc Nissl染色和TH免疫熒光染色結果

Figure 6.The distribution of POMC and Iba1 in the Arc of control and 6-OHDA rats (×200).

圖6 2組大鼠Arc中POMC和Iba1免疫熒光染色

討 論

脂肪減少是PD病人消瘦的主要原因[3]，Arc作為作為調控機體能量代謝和食欲的重要核團，其內的多巴胺能神經元(TH陽性神經元)和POMC神經元都參與外周脂肪的調控。本研究用6-OHDA損傷大鼠SN后引起腹膜后脂肪的顯著減少，并伴隨Arc中TH減少、Iba1增多和POMC增多，提示腹膜后脂肪減少與Arc內調控能量代謝的神經元改變存在關聯，TH、Iba1和POMC的表達變化可能參與與帕金森患者消瘦發病機制。

存在于Arc的POMC為促腎上腺素皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)和β-促脂解素(β-lipotropin，LPH)的前體，ACTH可繼續合成α-黑素細胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，MSH)，LPH可繼續合成β-MSH和β-內啡肽(β-endorphin)。

Figure 7.The protein expression of TH, Iba1 and POMC in the hypothalamus of control and 6-OHDA rats. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖7 Western blot檢測2組大鼠下丘腦處TH、POMC和Iba1蛋白的表達

Arc POMC源的MSH、β-MSH和β-內啡肽能夠通過下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)中的黑皮質素3型受體(melanocortin 3 receptor，MC3R)和黑皮質素4型受體(melanocortin 4 receptor，MC4R)可以通過激活脂肪分解作用并抑制餓感的產生而對機體的脂質代謝起到直接的調控作用[8-9]。相反，POMC的缺失導致犬類的肥胖、食欲的劇烈增強[10]以及人類的肥胖、脂肪含量的增加[11]。以上的證據能夠充分說明POMC參與調控機體能量代謝以及食欲。

在本實驗中，6-OHDA組大鼠Arc中POMC能神經元數量顯著增加，說明POMC可能參與了6-OHDA組大鼠腹膜后脂肪的減少。6-OHDA組大鼠的體重與對照組比較未有明顯改變，我們推測原因可能是注射6-OHDA后飼養周期較短造成。TH是多巴胺神經元中多巴胺合成的限速酶。Arc中的TH陽性的神經元大部分為多巴胺能的神經元[12]。Arc中的POMC能神經元抑制食欲，增強代謝，其活性受到多巴胺能的負調控[5]：加入了多巴胺的POMC細胞，其活性顯著降低，加入多巴胺受體1抑制劑SKF38393后POMC的電活動不受影響，而加入多巴胺受體2激動劑奎匹羅后POMC細胞的電活動幾乎消失，以上結果證明了Arc中的TH對POMC有著直接的負調控作用。在本實驗中，Arc中TH顯著降低，說明升高的POMC的表達有可能來自于TH活性的降低。Arc能夠整合外周以及旁分泌信號并傳導至第二級神經元并調控攝食與能量代謝[13-14]。Arc結構上缺失血腦屏障，使其能夠快速并直接感知來自于外周的營養狀態變化[15]，如游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)。在高脂誘導的肥胖小鼠模型中，24 h的高脂喂養后，Arc能夠敏銳地感受外周FFA的變化并迅速引起Arc中的小膠質細胞的大量產生而導致下丘腦炎癥[16]。本實驗中，Arc小膠質細胞增加，原因可能為增加的POMC活性激活了外周脂質的分解而導致FFA含量的上升，從而引起了Arc小膠質細胞的增生。

綜上所述，本實驗用6-OHDA損傷雙側SN中的多巴胺能神經元，發現大鼠的體重無明顯變化，腹膜后脂肪含量減少，Arc中TH表達下降，POMC和Iba1的表達水平升高，三者的含量的變化可能與6-OHDA大鼠腹膜后脂肪減少有聯系，為揭示PD患者消瘦的發病機制提供了依據。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Changes of ionized calcium binding adapter molecule 1 and pro-opiome-lanocortin expression in arcuate nucleus of hypothalamus induced by substantia nigra lesion with 6-hydroxydopamine

ZHANG Yi-min1, LIAN Hui1, SONG Hai-yan1, ZHOU Li1, CAI Jun-yan2, WANG Zhi-yong1

(1HenanKeyLaboratoryofMedicalTissueRegeneration,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003,China;2ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China.E-mail:wanliheng@vip.163.com)

AIM: To observe the expression of tyrosine hydroxylase (TH), ionized calcium binding adapter molecule 1 (Iba1) and pro-opiomelanocortin (POMC) in rat arcuate nucleus (Arc) of hypothalamus induced by substantia nigra (SN) lesion with 6-hydroxydopamine (6-OHDA). METHODS: According to the random number table, 20 SD rats were randomly divided into 6-OHDA group and control group. 6-OHDA was injected into the bilateral SN of the rats in 6-OHDA group, and the same volume of saline was injected into the same position of the rats in control group. After 6 weeks, the rats were sacrificed and the brains were obtained. Immunofluorescence staining and Western blot were used to detect TH expression in the SN, and TH, Iba1 and POMC expression in the Arc. RESULTS: Compared with control group, no significant change of body weight in 6-OHDA group was observed, but the weight of retroperitoneal fat decreased from (7.550±0.670) g to (3.895±0.465) g (P<0.01). The number of TH immunoreactive neurons in SN decreased from 56±5 to 14±2 (P<0.05), and the TH protein level decreased from 0.75±0.11 to 0.41±0.09 (P<0.01). In the Arc, the number of TH immunoreactive neurons decreased from 21±2 to 10±3 (P<0.05), the number of Iba1 immunoreactive neurons increased from 12±2 to 30±5 (P<0.05), and the number of POMC immunoreactive neurons increased from 16±4 to 31±2 (P<0.05). In the hypothalamus, the TH protein level decreased from 0.35±0.05 to 0.21±0.02 (P<0.01), the Iba1 protein level increased from 0.23±0.06 to 0.51±0.04 (P<0.01), and the POMC protein level increased from 0.37±0.05 to 0.65±0.03 (P<0.01).CONCLUSION: The changes of TH, Iba1 and POMC expression in Arc of 6-OHDA-treated rats may involved in the fat loss in Parkinson’s disease.

6-Hydroxydopamine; Arcuate nucleus; Tyrosine hydroxylase; Ionized calcium binding adapter molecule 1; Pro-opiomelanocortin

1000- 4718(2017)06- 0975- 06

2016- 03- 16

2017- 04- 27

國家自然科學基金資助項目(No. 31200897)；新鄉醫學院博士科研基金(No. XYBSKYZZ201501)；河南省醫用組織再生重點實驗室開放課題(No. KFKT16003)

R322.85； R741

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.003

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