液質聯用法測定水產品中氯霉素殘留的技術研究

曾 智 朱志強 易 鳴

科研園地

液質聯用法測定水產品中氯霉素殘留的技術研究

曾 智 朱志強 易 鳴

氯霉素（Chloroamphenicol，CAP）是一種有效的廣譜抗生素，常用于動物各種傳染性疾病的治療，對多種病原菌有較強的抑制作用，人們經常使用氯霉素進行水體消毒和防治漁業病蟲害，但由于氯霉素對人體產生嚴重的毒副作用，是多個國家禁止使用的獸用藥物。目前水產品中氯霉素的殘留主要用GB/T20756-2006國家標準進行檢測，本文在此標準的基礎上進一步優化了前處理方法，提高了檢測效率，并且能夠達到規定的重現性和準確性。具體通過液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/ MS），多反應監測掃描模式（MRM）和同位素內標法定量，直接對草魚、鱖魚、對蝦等水產品中的氯霉素進行了檢測。

一、實驗材料

1.儀器

AB QTRAP4500液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀，配電噴霧離子源（ESI）、勻漿機、離心機、超聲波清洗儀、垂直振蕩器、氮吹儀等。

2.材料

草魚、鱖魚、對蝦等水產品，均采自于養殖場和農貿市場，去皮去骨去內臟取可食部分切碎、混勻、冷凍，作為樣品備用。

3.試劑和藥品

甲醇（色譜純）德國Merck（默克）公司；乙酸乙酯（分析純）、正己烷（分析純）、氫氧化銨（25%-28%）（分析純）國藥集團。

表1 梯度洗脫液比例

表2 氯霉素（CAP）和氘代氯霉素（CAP-D5）的質譜參數

4.標準品

氯霉素（CAP）標準品德國Dr公司、氘代氯霉素（CAP-D5）BESTOWN北京振翔科技有限公司。

表3 標準工作曲線

二、實驗儀器方法

1.色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（1.9μm×2.1mm ×50mm）；柱溫40℃；進樣量10.0μL；流動相乙腈和水，流速0.4mL/min，運行時間6min。

2.質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），負離子掃描，多反應監測掃描模式（MRM）；霧化器、碰撞器為氮氣。質譜參數見表2。

三、實驗步驟

1.標準溶液的配置

氯霉素標準儲備液（100.0μg/mL）用甲醇配置，氯霉素標準中間工作液（40.0ng/mL）用水稀釋；氘代氯霉素標準使用液（20.0ng/mL）用水稀釋。

準確量取一定量的氯霉素標準中間工作液，用水稀釋成濃度為0.10ng/mL、0.25ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/ mL、3.50ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL的標準系列使用液，氘代氯霉素的濃度均為1.50ng/mL。

2.樣品前處理

樣品的前處理過程比較重要，直接影響檢測結果，提取步驟如下：準確稱量5.00g勻漿樣品，置于50mL離心管中，加入20ng/mL的內標標準溶液75.0μL，加入15mL乙酸乙酯，0.4mL氫氧化銨，垂直振蕩1min，4500轉離心5min，取上清液至另一50mL離心管中，重復提取一次，合并提取液，混勻。取10mL提取液40℃氮吹吹干，加入1.0mL水渦旋，再加入2mL正己烷渦旋30秒，4500轉離心5min，棄去上清液，樣液經0.22μm有機濾膜過濾后，待上機分析。

3.樣品加標回收率的測定

準確稱取氯霉素的陰性樣品5.00g，添加濃度為40.0ng/mL的氯霉素使用液12.5μL、62.5μL、87.5μL共3組，加入濃度為20.0ng/mL的內標標準溶液75.0μL，每組5個平行樣。

表4 氯霉素的添加濃度及其平均回收率的實驗數據（n=5）

四、結果與討論

1.氯霉素的標準工作曲線

按上述色譜和質譜條件測定一系列6個質量濃度的氯霉素的標準曲線，以標準物質的質量濃度與內標物的質量濃度之比為橫坐標，標準物質的峰面積與內標物的峰面積之比為縱坐標，繪制標準工作曲線（見表3），線性范圍為0.25-5.00ng/mL，線性方程為y=0.45422x+0.01047，線性相關系數為0.99993，定量限為0.10μg/kg，在以實驗所取的0.10-10.00ng/mL之間的8個點做線性回歸時，當用10.00ng/mL作為標準曲線的最大濃度時，低濃度的點偏差較大，高于實際濃度的50%左右，所以該線性關系不適用于氯霉素含量高的水產品檢測。

2.不同水產品中氯霉素含量的檢測結果（見表4）

氯霉素檢測的線性范圍為0.25-5.00ng/mL，定量限為0.10μg/kg，在加標量為0.10μg/kg、0.50μg/kg、1.00μg/kg時，樣品加標回收率均在80%-120%之間，相對標準偏差（RSD）均小于10.0%。

3.結論

目前水產品中氯霉素的殘留主要按照國家標準GB/T20756-2006進行檢測，此方法在實際操作中操作步驟較為繁瑣，前處理時間較長，且存在一定的污染風險。本實驗優化了前處理方法，用氮吹取代旋蒸，同時簡化操作步驟，節省操作時間，且檢測結果均能滿足檢測要求，提高了檢測效率，但本實驗方法也有一定局限性，當樣品中氯霉素含量超過1μg/kg時，線性要求可能無法滿足，此時我們可以通過減少取樣量或增加內標液的加入量等方法進行改善。綜上所述，我們在液質聯用法測定水產品中氯霉素殘留時，應根據自己的實際情況和需求來選擇適當的前處理方法，已達到較好的檢測效果。

（通聯：430070，農業部漁業環境及水產品質量監督檢驗測試中心·武漢 電話：13971303160）