小鼠肝組織掃描電鏡樣本的制備及改良方法*

姚瑩華陳育堯呂志平

[文章編號] 1672-8270(2017)06-0165-03 [中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A

小鼠肝組織掃描電鏡樣本的制備及改良方法*

姚瑩華①陳育堯②呂志平②

目的：探討優化小鼠肝組織掃描電鏡樣本的制備方法。方法：通過改良灌注固定的部位、優化灌注材料及步驟、采用經門靜脈灌注固定和改變固定流程等制備小鼠肝臟掃描電鏡樣本，并對比改良制備方法與常規制備方法的組織細胞形態觀察結果。結果：改良后的樣本制備方法較好地保存了小鼠肝組織以及細胞的生活狀態，可清晰觀察肝臟組織及細胞的超微形態結構，獲得了頗為理想的觀察效果，且操作簡便，成功率高，優于傳統制備方法。結論：經門靜脈灌注固定制備小鼠掃描電鏡樣本是比較優越的掃描電鏡制樣方法，具有一定應用價值。

肝組織；掃描電鏡；樣本制備；改良方法

電子顯微鏡術的應用使人們對肝臟的認識從組織學水平上升到細胞器水平，并進入分子生物學研究領域[1]。掃描電鏡可清晰地觀察物體表面的立體微細結構及其形態學變化，從三維水平研究肝臟的亞微結構，是現今一種較為常見和實用的形態學研究方法[2]。實驗發現，肝臟細胞的超微結構只能在完整的肝組織或培養的細胞中使用電子顯微鏡進行觀察，而理想的生物樣品應如實反映其生理過程中的狀態，在高真空和強電子束的轟擊下保持穩定，且亞微結構清晰、無變形[3-4]。理想的生物樣品與樣品的制備技術密切相關，由于小鼠門靜脈短且壁薄，其樣品制備為一大技術難點。因此，本研究對小鼠肝組織掃描電子顯微鏡標本的制備方法進行改良。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

NIH小鼠，雄性，體重18～22 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 儀器與試劑

(1)S-3000N型掃描電子顯微鏡(HITACHI，日本)；HPC-2型CO2臨界點干燥器(HITACHI，日本)。

(2)二甲胂酸鈉購自Amresco公司；25%戊二醛(美國SIGMA公司)；1%四氧化鋨為進口分裝(美國SIGMA公司)；24 G一次性靜脈留置針、一次性輸液器、一次性輸液瓶和T型連接管均由南方醫科大學中西醫結合醫院提供。

1.3 緩沖液和固定液的配制

(1)0.1 mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液(pH值為7.4)：二甲胂酸鈉4.28 g，0.2 NHCl 2.7 ml加蒸餾水至200 ml。

(2)1.5%戊二醛固定液(pH值為7.4)：0.2 mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液50 ml，25%戊二醛6 ml，加蒸餾水至100 ml。

1.4 肝臟灌注固定

將緩沖液和固定液分別裝入輸液瓶中，連接輸液器和“T”形連接管，調節輸液器使其中無氣泡。①實驗小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，酒精棉球皮膚消毒，打開腹腔暴露門靜脈及下腔靜脈；②用彎型鑷分離門靜脈，取一定長度4#絲線從分離的門靜脈下端穿過，打一個留有少許空隙的活結；③用清潔棉球壓迫于胃食管靜脈叢上端，使門靜脈充盈，用24 G一次性靜脈留置針從門靜脈主干遠端刺入，待針尾部有回血時迅速抽出針芯，用鑷子拉緊預先打好的活結，再打一結將留置針與門靜脈固定，使之不能退出，然后將針尾部與緩沖液輸液器連接，打開調節閥，灌注緩沖液，調節灌流量至5～7 ml/ min；④迅速切斷下腔靜脈，使血液和緩沖液流出，并觀察血液流出情況和肝臟變化；⑤當流出的血液逐漸由紅轉淡，肝臟發白時旋轉“T”形管，使之對準固定液，開始灌注1.5%戊二醛，待肝臟變硬后，迅速切取肝組織，并置于冰上切塊取材，放置于1.5%戊二醛固定液中，于4 ℃冰箱中保存備用[5]。

1.5 掃描電鏡樣本的處理

樣品浸于戊二醛中固定3 h后，于4 ℃下用0.1 mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液(pH值為7.4)反復漂洗數次，并將組織置于緩沖液中過夜。第2 d除去緩沖液，加入1%的鋨酸固定1 h，棄固定液，再用緩沖液反復漂洗5次，每次15 min。梯度乙醇脫水(50%、70%、90%、100%)3次，每次15 min，乙酸異戊酯置換2次，第1次5～10 min，第2次＞30 min。將置換后的組織取出放于濾紙上，待部分液體吸收，剪取適當大小濾紙放于樣品干燥籠內，并進行標記。組織放入標記后的樣品干燥籠，封口后連籠移入CO2臨界點干燥器樣品杯內，將蓋擰緊，以防漏氣。樣品干燥后取出，放于事先標記的樣品袋中。光學顯微鏡下觀察樣本大體結構，鏡下將大塊組織分離成不同不規則斷面的組織小塊，選取需要觀察的斷面，用導電膠粘合于樣本觀察板上，真空噴鍍金膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.6 掃描電鏡樣本的觀察

使用低倍鏡找到每個標本的匯管區，定位于匯管區周圍，觀察5個斜斷面肝組織形態結構，調節觀察倍數和焦距仔細觀察所要觀察的部位和細胞；然后在遠離匯管區的部位找5個視野，觀察5個斜斷面。觀察肝細胞、肝血竇、間質細胞以及肝內血管和毛細小膽管的形態結構[6]。

2 結果

通過經門靜脈灌注固定方法制得的小鼠肝組織，掃描電鏡樣本表面結構保持完整，無污染，無擠壓龜裂。在電鏡下觀察肝細胞、肝竇內皮細胞及其窗孔結構、其他間質細胞、少量淋巴細胞和毛細膽管。肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細胞表面可見清晰的毛細小膽管結構，部分肝細胞在斷裂過程中破裂，細胞器掉落。經改良后采用經門靜脈灌注固定小鼠肝組織，可見清晰的肝血竇及肝竇內皮細胞窗孔，個別血細胞和炎性細胞附著肝竇腔。而未經改進的灌注方法，鏡下肝細胞正常結構難以辨認(如圖1所示)。

圖1 小鼠肝組織掃描電鏡樣本(×8.0 K)

3 討論

肝臟是全身代謝最為旺盛的器官，同時又是各種細胞器最有代表性的器官之一，機體各種疾病都會直接或者間接地影響肝細胞的亞微結構[7]。病理檢查是反映肝臟病理學變化的最直接指標，由于肝臟容易取得生理狀態下的樣品，肝臟活檢常成為臨床診斷的直接證據。肝臟是體內重要的代謝和免疫器官，組織結構致密，離體后迅速自溶，固定不及時將難以保持生活狀態下樣品原貌，細胞內的微細變化即刻呈現電鏡假象。掃描電鏡要求觀察樣品結構完整且清潔無雜物，但由于肝臟血流及代謝物豐富，血細胞與組織液等易沉積于肝組織內表面，造成對電鏡圖像的錯誤理解[8]。灌注壓升高，固定劑和緩沖液的滲透壓不正確，固定不足，并且固定后脫水和干燥的速度都是可能產生干擾超微結構保存的人為因素[9-10]。因此，掃描電鏡樣本固定前應做好表面清潔，且從標本的取材到后續處理過程都應盡量做到符合活體狀態下的生理條件，如緩沖液和固定液的離子濃度、pH值、滲透壓及溫度等[11]。

掃描電鏡不同于透射電鏡，組織塊過小不易形成自然斷裂層，從而影響觀察效果。而固定液滲透力有限，較大的組織塊所需滲透時間長，單純浸泡于固定液中容易出現滲透不足導致組織細胞自溶，造成結構的損壞。采用門靜脈灌注固定制備小鼠掃描電鏡樣本，通過血管灌注固定肝臟能夠及時地保存肝組織和細胞正常存活狀態，減少離體死亡后引起的自溶變化，為取材與修整爭取了時間。此外，能清潔樣品內表面的血細胞及組織液體，使鏡下視野清晰，觀察效果良好。一般多采用插入心臟的全身灌注法，操作較簡單。但肝臟則應采用局部灌注法，經門靜脈灌注能更快、更及時地固定正常存活狀態下的肝組織，且固定均勻，速度快，灌注效果優于全身灌注。停止血液流動后應盡可能快地進行固定，以防止由于組織細胞自溶而發生的超微結構變化[12]。灌注時，由于灌注針頭非常容易從門靜脈管腔中滑脫，采用4#絲線將灌注針與門靜脈固定，有效的提高了灌注的成功率。以往灌注多采用金屬注射針頭，但其表面光滑，絲線結扎易滑脫，且小鼠的門靜脈管壁較薄，金屬針頭易造成管壁破損，導致灌注失敗或灌注不全。因此，采用24 G靜脈留置針，刺入門靜脈針尾有回血后退出金屬針芯，將留置針的套管和門靜脈用絲線結扎固定。經反復驗證，結扎穩固，不會輕易發生位移、脫落。此外，灌注時應注意下腔靜脈流出液情況，隨著流出血液顏色逐漸變淡，肝臟逐漸發白，表明灌注位置正確；若無液體流出或肝臟無明顯變化，則可能是針頭刺入過深，穿破門靜脈，或刺入位置不正確，應及時停止灌注，重新調整針頭位置，直至肝臟變化，但調整應盡量在短時間內完成，以免發生組織自溶。肝臟變硬后可停止，取材速度要快，修整后放入固定液中于冰箱內4 ℃保存。

灌注液的滲透壓，pH值應與固定液一致，不同滲透壓會導致組織細胞形態發生變化，最好用同種緩沖液配所需固定液。固定足夠時間后用緩沖液清洗組織塊，目的是除去固定液及組織表面的雜質，清洗不足則樣品表面雜質較多，影響鏡下觀察，可清洗4～6次，每次30 min，或放置于冰箱內4 ℃保存12 h。換液過程中吸管應盡量不觸碰組織，亦要避免樣品長時間裸露在空氣中發生改變。組織脫水采用“乙醇梯度脫水法”，其脫水力度較丙酮緩和，根據樣品的大小而確定具體脫水時間，避免過度脫水造成組織收縮變化，每次15 min左右。干燥時采用“臨界點干燥法”，可減少組織細胞表面的張力，使樣品得到更好的保護。該制備方法較好的保存了肝組織以及細胞的生活狀態，獲得了頗為理想的觀察效果，優于以往傳統制備方法，具有一定的應用價值。

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Preparation of specimen about mouse liver tissue for scanning electron microscope and its improvement method/

YAO Ying-hua, CHEN Yu-yao, LV Zhi-ping//China Medical Equipment,2017,14(6):165-167.

Objective: To explore and optimize the preparation method of specimen about mouse liver tissue for scanning electron microscopy. Methods: The specimens of mouse liver using for scanning electron microscope were prepared through improving the fixed location of perfusion, optimizing material and procedure of perfusion, adopting fixation of perfusion via portal vein and changing the process of fixation and so on. And the results of morphological observation of histocyte were compared between the improved method and traditional method. Results: The improved preparation method could save the liver tissue and the living state of the cells in preferably situation. By using this method, the ultra-micro morphological structure of liver tissue and cell could be clearly observed and the ideal effect of observation could be achieved. Besides, its operation was simple and its success rate was high. Therefore, it was superior to traditional method. Conclusion: The preparation of specimen about the fixation of mouse liver tissue via perfusion of portal vein for scanning electron microscope is a superior method, which has certain applied value.

Liver tissue; Scanning electron microscopy; Specimen preparation; Improvement method

Shantou Hospital of TCM, Guangzhou University of Chinese Medicine, Shantou 515031, China.

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.06.045

[文章編號] 1672-8270(2017)06-0165-03 [中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A

姚瑩華,女,(1984- ),博士研究生，主治醫師。廣州中醫藥大學附屬汕頭中醫院科教科，從事消化系統疾病的中西醫臨床診治。

2017-03-23

國家自然科學基金(30973699)“肝竇內皮細胞的調節機制與肝主疏泄的相關性研究”

①廣州中醫藥大學附屬汕頭中醫院科教科 廣東 汕頭 515031

②南方醫科大學中醫藥學院 廣東 廣州 510515