X射線及UVB對人表皮細胞細胞增殖及褪黑素受體表達的影響*

高 玲李至薈封江彬陸 雪蔡恬靜李 爽趙 驊田雪蕾劉青杰*

X射線及UVB對人表皮細胞細胞增殖及褪黑素受體表達的影響*

高 玲①李至薈②封江彬①陸 雪①蔡恬靜①李 爽①趙 驊①田雪蕾①劉青杰①*

目的：研究X射線和紫外線B(UVB)對表皮細胞增殖的影響，以及對褪黑素受體(MTNR)蛋白表達的影響，為生活在高海拔地區可能受到較高電離和非電離輻射的公眾輻射效應及其防護提供指導。方法：經照射劑量為0 Gy(對照組)、0.5 Gy、2 Gy和5 Gy(照射組)X射線以及0 mJ/cm2、20 mJ/cm2、50 mJ/cm2、100 mJ/cm2和200 mJ/cm2的UVB分別照射人表皮細胞Hacat和人黑色素瘤細胞A875，通過四甲基偶氮唑(MTT)和克隆形成率實驗檢測細胞增殖能力變化，采用蛋白質印跡法檢測褪黑素受體MTNR-1B蛋白表達變化。結果：在照射劑量為0.5 Gy、2 Gy和5 Gy的X射線以及20 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB的照射下，可導致Hacat和A875細胞生長不同程度的降低。3種不同劑量X射線照射后Hacat細胞克隆形成率分別為對照組的71.2%、36.7%和16.3%，與對照組比較差異有統計學意義(F=249.96，P＜0.05)，A875細胞細胞克隆形成率分別為對照組的64.7%、49.5%和31.6%，與對照組比較差異有統計學意義(F=147.29，P＜0.05)；在照射劑量為20 mJ/cm2和50 mJ/cm2的UVB照射后Hacat細胞的克隆形成率分別為對照組的40.74%和12.96%，A875細胞的克隆形成率分別為對照組的16.33%和6.12%；50 mJ/cm、100 mJ/cm和200 mJ/cm2的UVB照射后A875細胞中MTNR1B表達隨著劑量的增大而顯著增加，而3種不同劑量X射線對MTNR1B表達在不同劑量之間無顯著影響。結論：X射線和UVB照射后均可引起細胞增殖和存活能力的降低，UVB照射后引起的細胞增殖抑制可能與褪黑素受體表達變化相關。

X射線; 紫外線B(UVB); 細胞增殖; 褪黑素受體；蛋白印跡法

褪黑素(melatonin，MEL)是對光線和射線非常敏感的一類激素，通常過強的紫外線照射可導致褪黑素分泌的減少。MEL通過與褪黑素受體，即特異性膜受體或核受體結合而產生效應，具有延緩衰老、調節免疫、改善睡眠、抗擊腫瘤以及引起DNA損傷等作用[1-3]。MEL在人體組織視交叉、嗅球、中腦、下丘腦、橋腦、延髓、海馬和小腦等神經系統組織、視網膜、免疫系統、生殖系統以及內分泌系統等外周組織中均有分布。血清中褪黑素水平存在晝夜節律性變化，表現為夜間分泌到峰值而白天降至谷值。褪黑素受體屬于G蛋白偶聯受體超家族，有7個跨膜結構，不僅存在于神經系統，也廣泛存在于免疫系統、生殖系統和內分泌系統等。且褪黑素受體也存在晝夜節律，節律也是自主的，受控于晝夜節律起步點而不受控于褪黑素的節律[4]。電離輻射及非電離輻射對褪黑素及其受體的影響尚不明確，因此本研究初步探索X射線和UVB對人表皮細胞細胞增殖及褪黑素受體表達的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

(1)Precise直線加速器(瑞典Elekta公司)；SH4B-T紫外光療儀(上海Sigma公司)；

Thermo Labsystems MK3酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

(2)特級胎牛血清和DMEM培養基購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)試劑購自美國Sigma公司；D-Hank's緩沖液、甲醛溶液、姬姆薩染色液以及PBS緩沖液均為本實驗室配制；蛋白提取試劑盒及蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司；NC膜購自美國GE公司；MTNR1B抗體及β-肌動蛋白抗體購自美國Santa cruz公司；人表皮細胞Hacat、人黑色素瘤細胞A875購自北京協和醫學院細胞庫。

1.2 細胞培養與分組

細胞株采用含有10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養液培養。實驗分為照射組和對照組，照射組的X射線吸收劑量分別為0.5 Gy、2 Gy和5 Gy；UVB吸收劑量分別為20 mJ/ cm2、50 mJ/cm2、100 mJ/cm2和200 mJ/cm2；對照組X射線和UVB照射的吸收劑量均為0。

1.3 X射線與紫外線B照射

X射線照射使用Precise直線加速器產生的X射線單次照射細胞，源靶距為100 cm，能量為6 MV，照射組吸收劑量分別為0.5 Gy、2 Gy和5 Gy，采用電離室進行劑量校準；紫外線B(ultraviolet B，UVB)照射采用SH4B-T紫外光療儀，UVB發射光波長為311～313 nm，照射距離約為40 cm。照射劑量采用本所輻射防護與建設項目評價室TN-2340紫外線強度計校準細胞，照射組吸收劑量分別為20 mJ/cm2、50 mJ/cm2、100 mJ/cm2和200 mJ/cm2。

1.4 MTT實驗

細胞濃度調整為5×104/ml；取24孔培養板，各孔加0.2 ml培養液，設5個復孔，在37 ℃培養箱培養2%滅活胎牛血清；分別培養至1 d、2 d和3 d，在相應的孔里加入20 μl四甲基偶氮唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色試劑，繼續在培養箱中培養4 h；在每孔中加入100 μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩混勻10 min后使用Thermo Labsystems MK3酶標儀檢測波長492 nm處的吸光度(D492)值。

1.5 克隆形成率實驗

常規消化指數生長期的細胞，用DMEM培養液懸成單細胞后置于10 ml離心管中，密封照射，各組細胞分別接種于5 ml預溫37 ℃培養液的60 mm培養皿中，接種500個細胞。以十字方向輕輕晃動培養皿，使細胞分散均勻。將培養皿移入CO2培養箱，在37 ℃、CO2體積分數為5%和95%濕度環境下靜止培養7 d后終止培養。用預溫的D-Hank's洗滌2遍后，甲醇固定20 min，去甲醇，姬姆薩染色液染色15 min，沖洗晾干后解剖顯微鏡下計數克隆數，克隆形成率(colony forming efficiency，CFE)計算為公式1：

生存分數(survival fraction，SF)計算為公式2：

1.6 蛋白提取及Western blot

消化并收集細胞，按Pierce蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，取50 μg上樣，制備12%的聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，將蛋白轉移至NC膜，分別用抗MTNR1B抗體(工作濃度1∶1000)及抗β-肌動蛋白多抗(工作濃度1∶500)檢測MTNR1B及β-肌動蛋白的表達，一抗及二抗孵育后，采用增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)法顯影。電泳條帶經ImageJ軟件處理計算積分光密度(integrated density)，使用光密度總和÷面積計算積分光密度，目的條帶與內參照條帶的比值代表目的蛋白的表達水平。

1.7 統計學方法

應用SPSS 12.0統計軟件進行數據處理，數據符合正態分布，兩組比較采用獨立樣本，每個照射組均與對照組配對，照射組與對照組之間的比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量X射線照射對細胞增殖的影響

利用MTT和克隆形成率方法檢測兩組X射線對Hacat和A875細胞增殖的影響，MTT結果顯示Hacat和A875細胞增殖如下。

(1)Hacat細胞照射后48 h，照射組吸收劑量0.5 Gy、2 Gy和5 Gy與對照組相比，細胞增殖能力均出現降低，兩組比較差異有統計學意義(F=249.96，P＜0.05)；照射后72 h吸收劑量0.5 Gy和5 Gy與對照組相比，細胞增殖能力均出現統計學差異的降低；吸收劑量2 Gy與0.5 Gy相比，出現統計學差異的降低；吸收劑量5 Gy與2 Gy比較，出現統計學差異的降低(見表1)。

(2)A875細胞照射后24 h和48 h，吸收劑量0.5和5 Gy與對照組相比，細胞增殖能力出現顯著降低，差異有統計學意義(F=174.29，P＜0.05)。照射后72 h，吸收劑量0.5 Gy、2 Gy和5 Gy與對照組相比，細胞增殖能力均出現明顯降低；吸收劑量2 Gy與0.5 Gy相比，出現明顯降低；吸收劑量5 Gy與2 Gy比較，細胞增殖能力出現明顯降低(見表2)。

(3)克隆形成率實驗結果顯示，X射線照射2種細胞后克隆形成率在吸收劑量0.5 Gy、2 Gy和5 Gy不同劑量間均出現統計學差異。Hacat細胞克隆形成率分別為對照組的71.2%、36.7%和16.3%，如圖1所示。

A875細胞細胞克隆形成率分別為對照組的64.7%、49.5%和31.6%。如圖2所示。

2.2 UVB照射對細胞增殖的影響

(1)經0、20 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB照射后，人表皮細胞Hacat、人黑色素瘤細胞A875的MTT吸光度數值均出顯著降低(見表3、表4)[5]。

(2)細胞受到照射后，部分細胞盡管DNA發生損傷，卻仍然可以進行1～2代細胞分裂，但最終喪失細胞的再分裂和增殖能力。為了更準確檢測射線對細胞增殖能力的遠后影響而進行克隆形成率實驗。采用20 mJ/cm2和50 mJ/cm2的UVB照射后進行克隆形成率實驗，Hacat、A875的克隆形成率和存活分數均顯著降低。其中在50 mJ/cm2劑量時對UVB紫外線耐受性較強的Hacat細胞克隆形成率和存活分數分別為3.11%和12.96%，克隆形成率為對照組的12.96%；對UVB紫外線耐受性較弱的A875細胞克隆形成率和存活分數分別為0.67%和6.12%，克隆形成率為對照組的6.12%，見表5[5]。

表1 MTT檢測兩組X射線對Hacat 細胞生長的影響

表1 MTT檢測兩組X射線對Hacat 細胞生長的影響

注：*表示48 h照射組與對照組細胞吸光值比較有統計學意義；&表示72 h照射組與對照組細胞吸光值比較有統計學意義；#表示72 h照射組與0.5 Gy組細胞吸光值比較有統計學意義；$表示72 h照射組與2 Gy組細胞吸光值比較有統計學意義。

組別劑量( G y ) F值P值0 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h H a c a t細胞不同培養時間吸光度( O D 4 9 2 ) 0 . 5 0 . 2 4 9 5 ± 0 . 0 0 0 1 0 . 2 6 1 6 ± 0 . 0 0 2 1 0 . 2 6 9 6 ± 0 . 0 0 3 4*0 . 4 3 6 5 ± 0 . 0 0 9 5&2 0 . 2 4 8 4 5 ± 0 . 0 0 0 2 0 . 2 6 3 6 ± 0 . 0 0 2 7 0 . 2 6 9 2 ± 0 . 0 0 3*0 . 4 6 7 ± 0 . 0 3 0 3#5 0 . 2 4 8 4 ± 0 . 0 0 0 6 0 . 2 6 1 3 ± 0 . 0 0 1 2 0 . 2 6 8 3 ± 0 . 0 0 3 7*0 . 4 2 9 7 ± 0 . 0 1 8 4&$對照組 0 0 . 2 4 7 3 4 ± 0 . 0 0 1 9 0 . 2 5 8 8 ± 0 . 0 0 0 7 0 . 2 8 9 4 ± 0 . 0 0 7 5 0 . 4 8 ± 0 . 0 0 1 6 2 4 9 . 9 6＜0 . 0 5照射組

表2 MTT檢測兩組X射線對A875細胞生長的影響

表2 MTT檢測兩組X射線對A875細胞生長的影響

注：*表示24 h照射組與對照組細胞吸光值比較有統計學意義；&表示48 h照射組與對照組細胞吸光值比較有統計學意義；#表示72 h照射組與對照組細胞吸光值比較有統計學意義；$表示72 h照射組與0.5 Gy組細胞吸光值比較有統計學意義；?表示72 h照射組與2 Gy組細胞吸光值比較有統計學意義。

組別劑量( G y ) F值P值0 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h A 8 7 5細胞不同培養時間吸光度( O D 4 9 2 ) 0 . 5 0 . 2 6 8 ± 0 . 0 0 3 4 0 . 2 8 1 6 ± 0 . 0 0 3 1*0 . 2 9 1 2 ± 0 . 0 0 1 1&0 . 3 6 7 5 ± 0 . 0 1 6#2 0 . 2 6 4 5 ± 0 . 0 0 1 0 . 2 9 1 6 ± 0 . 0 1 0 . 3 0 3 7 ± 0 . 0 0 5 0 . 4 0 5 1 ± 0 . 0 1 1 6#$5 0 . 2 3 9 6 ± 0 . 0 0 3 2 0 . 2 7 3 3 ± 0 . 0 0 8 4*0 . 2 7 6 2 ± 0 . 0 0 3 1&0 . 4 3 4 8 ± 0 . 0 0 9 6#$?對照組 0 0 . 2 6 4 6 ± 0 . 0 0 2 3 0 . 3 1 6 5 ± 0 . 0 0 2 2 0 . 3 2 2 5 ± 0 . 0 0 5 0 0 . 5 0 9 4 ± 0 . 0 2 7 4 1 7 4 . 2 9＜0 . 0 5照射組

圖1 克隆形成率檢測不同劑量的X射線對Hacat細胞增殖的影響

圖2 克隆形成率檢測不同劑量的X射線對A875細胞增殖的影響

2.3 X射線和UVB對褪黑素表達的影響

利用蛋白質印跡(western blot，WB)實驗檢測褪黑素受體MTNR-1B蛋白表達，結果顯示，X射線對A875和Hacat細胞MTNR-1B表達無特別顯著的影響；經50 mJ/cm2、100 mJ/cm2和200 mJ/cm2UVB照射后A875細胞中MTNR-1B表達隨著劑量的增大而顯著增加(如圖3、圖4所示)。X射線和UVB對MTNR-1B蛋白表達的影響積分光密度比值如圖5所示。

表3 MTT檢測兩組UVB對Hacat細胞生長的影響

表3 MTT檢測兩組UVB對Hacat細胞生長的影響

注：表中*表示與對照組吸光值比較有統計學意義；表3引自參考文獻[5]。

組別M T T吸光度數值1 d 2 d 3 d對照組0 m J / c m20 . 3 3 0 7 ± 0 . 0 0 8 7 0 . 3 1 8 9 ± 0 . 0 0 7 0 . 4 2 8 3 ± 0 . 0 2 4 8照射組 2 0 m J / c m20 . 2 7 8 ± 0 . 0 0 1*0 . 2 2 9 ± 0 . 0 0 1*0 . 2 9 7 3 ± 0 . 0 0 1 2*5 0 m J / c m20 . 3 2 ± 0 . 0 0 4 4*0 . 2 7 1 3 ± 0 . 0 0 9 9*0 . 2 1 5 7 ± 0 . 0 1 3 7*

表4 MTT檢測兩組UVB對A875細胞生長的影響

表4 MTT檢測兩組UVB對A875細胞生長的影響

注：表中*表示與對照組吸光值比較有統計學意義；表4引自參考文獻[5]。

組別M T T吸光度數值1 d 2 d 3 d對照組0 m J / c m20 . 2 9 2 3 ± 0 . 0 0 1 5 0 . 3 8 1 7 ± 0 . 0 0 5 8 0 . 4 6 4 7 ± 0 . 0 1 1 4照射組2 0 m J / c m20 . 3 0 3 ± 0 . 0 0 8 7 * 0 . 2 5 3 3 ± 0 . 0 0 4 7 * 0 . 1 8 9 3 ± 0 . 0 0 1 5 * 5 0 m J / c m20 . 2 0 6 ± 0 . 0 0 3 6 * 0 . 2 1 6 7 ± 0 . 0 0 2 5 * 0 . 1 2 7 ± 0 . 0 1 1 *

表5 克隆形成率檢測UVB紫外線對Hacat、A875細胞增殖的影響(x-±s)

圖3 不同劑量X射線對MTNR1B蛋白表達的影響

注：圖中a和c使用A875細胞， b和d使用 Hacat細胞；其中a和b是X射線照射， c和d是UVB照射。

3 討論

褪黑素與褪黑素受體(MTNR1A和MTNR1B)具有良好的親和力，通過激活免疫活性細胞中的特異性受體，調節白細胞介素1α(interleukin-1α，IL-1α) IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ等細胞因子的生成和釋放，在多種疾病中發揮重要作用[6-9]。有研究表明，褪黑素可通過調節抗氧化物酶和自由基來發揮其輻射損傷防護的作用[10]。輻射對褪黑素受體表達的影響目前尚無定論。

研究表明，經50 mJ/cm2的UVB照射可引起表皮細胞Hacat增殖能力降低，發生凋亡和自噬[11-12]。克隆形成率實驗結果與前期研究結果一致，均表明經20 mJ/cm2和50 mJ/cm2的UVB照射后，HaCaT和A875細胞克隆形成率和存活分數均顯著降低。其中在50 mJ/cm2劑量時HaCaT細胞克隆形成率和存活分數分別為3.11%和12.96%；A875細胞克隆形成率和存活分數分別為0.67%和6.12%[5]。MTT和克隆形成率結果表明，經0.5 Gy、2 Gy和5 Gy的X射線和0 mJ/ cm2、20 mJ/cm2和50 mJ/cm2的UVB照射后可導致Hacat和A875細胞的增殖能力出現不同程度的降低。蛋白檢測結果表明，經50 mJ/cm2、100 mJ/cm2和200 mJ/cm2的UVB照射后，A875細胞中MTNR-1B表達隨著劑量的增大而顯著增加。這些結果提示，X射線和UVB照射后均可引起細胞增殖能力的降低，UVB照射后引起的細胞增殖抑制可能與褪黑素受體表達變化相關。

[1]Fathollahi A，Daneshgari F，Hanna-Mitchell AT.Melatoninand Its Role in Lower Urinary Tract Function：An Article Review[J].Curr Urol，2015，8(3)：113-118.

[2]Arushanian EB.Melatonin treatment of autoimmune and allergic pathology[J].Eksp Klin Farmakol，2015，78(8)：29-34.

[3]Manchester LC，Coto-Montes A，Boga JA，et al. Melatonin：an ancient molecule that makes oxygen metabolically tolerable[J].J Pineal Res，2015，59(4)：403-419.

[4]趙瑛.松果腺褪黑素受體研究現狀及展望[J].第二軍醫大學學報，2001，22(11)：1054-1057.

[5]高玲，李峰生，封江彬，等.不同種類細胞株對UVB紫外線的耐受性初探[J].癌變·畸變·突變，2014，26(5)：357-360.

[6]Emet M，Ozcan H，Ozel L，et al.A Review of Melatonin，Its Receptors and Drugs[J].Eurasian J Med，2016，48(2)：135-141.

[7]Cardinali DP，Vigo DE，Olivar N，et al.Melatonin Therapy in Patients with Alzheimer's Disease[J].Antioxidants(Basel)，2014，3(2)：245-277.

[8]Cardinali DP，Hardeland R.Inflammaging，Metabolic Syndrome and Melatonin：A Call for Treatment Studies[J].Neuroendocrinology，2017，104(4)：382-397.

[9]Tarnowski M，Malinowski D，Safranow K，et al. MTNR1A and MTNR1B gene polymorphisms in women with gestational diabetes[J].Gynecol Endocrinol，2017，33(5)：395-398.

[10]郭月鳳，田宇，張慧芳.褪黑素抗輻射作用研究進展[J].輻射防護通訊，2013(6)：23-26.

[11]An IS，An S，Choe TΒ，et al.Centella asiatica protects against UVB-induced Ha CaT keratinocyte damage through micro RNA expression changes[J].Int J Mol Med，2012，30(6)：1349-1356.

[12]Vitale N，Kisslinger A，Paladino S，et al.Resveratrol couples apoptosis with autophagy in UVB-irradiated Ha CaT cells[J].PLoS One，2013，8(11)：e80728.

Effects of X-ray and UVB for proliferation and the expression of melatonin receptor of human epidermal cells/

GAO Ling, LI Zhi-hui, FENG Jiang-bin, et al//China Medical Equipment,2017,14(6):156-160.

Objective: To explore the effects of X-rays and ultraviolet B (UVB) for the proliferation of human epidermal cells and the expression of melatonin receptor in human epidermal cells. This study can provide guidance about radiation effect and how to protect the public who may suffered higher ionization and non-ionizing radiation in high altitude region. Methods: Human epidermal cells (Hacat) and human melanoma cell lines A875 were irradiated with X-ray of different doses (0, 0.5, 2 and 5 Gy) and UVB of different doses (20, 50, 100 and 200 mJ/cm2), respectively. The change of cell proliferative capacity was detected by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and cloning efficiency experiment, and the change about expression of melatonin receptor (MTNR-1B) was detected by using western blot. Results: Cell proliferative capacity of Hacat and A875 were decreased in various degrees when they exposed in X-ray of different doses (0.5, 2 and 5 Gy) and ultraviolet B of different dose (20, 50 mJ/cm2). For Hacat cells, the cloning efficiencies of them in observation group after were irradiated by using X-ray of 3 kinds of doses were 71.2%, 36.7% and 16.3% of that in control group, and the differences between the two group were statistically significant (F=249.96, P＜0.05), respectively. While for A875 cells, the cloning efficiencies of them in observation group were 64.7%, 49.5% and 31.6% of that in control group at the same 3 kinds of doses, and the differences between the two group also were statistically significant (F=147.29, P＜0.05), respectively. On the other hand, after Hacat cells were radiated by using UVB of different doses (20 and 50 mJ/cm2), the cloning efficiencies of them in observation group were 40.74% and 12.96% of that in control group, respectively. And for A875 cell, they were 16.33% and 6.12% of that in control group at the same condition of dose, respectively. In addition, after Hacat cells were radiated by using UVB of 50 mJ/cm2, 100 mJ/cm2and 200 mJ/cm2, respectively, the results revealed that expression of MTNR1B was significantly increased with the enhancing of dose, while the X-ray of 3 kinds of doses were no significant effect for the expression of MTNR1B. Conclusion: Both of X-ray irradiation and UVB irradiation can cause the reductions of the capacities of proliferation and survival, and the inhibition of cell proliferation might be relative with the change of expression of melatonin receptor after UVB radiates cell.

X-ray; Ultraviolet-b(UVB); Cell proliferation; Melatonin receptor; Western blot

Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency, China CDC, National Institute for Radiological Protection, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100088, China.

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.06.043

1672-8270(2017)06-0156-05

R-33

A

高玲,女,(1978- ),博士，副研究員，碩士生導師。中國疾病預防控制中心輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，從事輻射損傷效應研究工作。

2017-04-25

國家自然科學基金面上項目(31570852)“STAT3調控caveolin-1介導的抗早衰在腫瘤輻射抗性中的作用及機制研究”；北京市自然科學基金面上項目(7162137)“UVB紫外線致黑素細胞早衰及對黑色素合成的調節機制研究”；中國疾病預防控制中心青年科研基金(2015A201)“利用負載lewis細胞的小鼠模型評價低劑量輻射對機體抗腫瘤免疫功能的影響”

①中國疾病預防控制中心輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室 北京 100088

②山西醫科大學第二臨床附屬醫院 山西 太原 030001

*通訊作者：qjliu@nirp.cn