不同時間介入電針治療對骨癌痛嗎啡耐受大鼠的療效評價

付桃芳 杜俊英 陳宜恬 房軍帆 梁宜 方劍喬

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院杭州310053

不同時間介入電針治療對骨癌痛嗎啡耐受大鼠的療效評價

付桃芳 杜俊英 陳宜恬 房軍帆 梁宜 方劍喬

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院杭州310053

[目的]觀察Walker256乳腺癌細胞所致骨癌痛嗎啡耐受大鼠的模型特點及不同時間介入電針治療對骨癌痛嗎啡耐受大鼠的療效。[方法]清潔級健康雌性SD大鼠53只，隨機分為6組：假手術(shù)組（Sham）、骨癌痛組（BCP）、骨癌痛-嗎啡耐受組（MT）、電針Ⅰ組（EA I）、電針Ⅱ組（EA II）、假電針組（ShamEA）。除sham組外，將10μL Walker256乳腺癌細胞（1×105cell）注入各組大鼠左側(cè)脛骨髓腔內(nèi)，于術(shù)后7d，將MT組、EAⅠ組、EAⅡ組、sham EA組骨癌痛制備成功的大鼠行腹腔注射鹽酸嗎啡（10mg·kg-1，2次/d）連續(xù)11d，誘導(dǎo)骨癌痛-嗎啡耐受模型。EA I組于嗎啡耐受前（即術(shù)后7d）介入電針干預(yù)，采用2/100Hz電針，刺激雙側(cè)“足三里”和“昆侖”穴，連續(xù)刺激18d；EA II組于嗎啡耐受后第1d（即術(shù)后18d）介入電針治療，方法同EAⅠ組，連續(xù)治療7d；ShamEA組大鼠僅給予針刺破皮，不予通電治療，其穴位及治療時間同EA II組。觀察大鼠患側(cè)機械縮足閾（paw withdrawal thresholds，PWT）評價電針治療效果。[結(jié)果]癌細胞接種后第6d（即術(shù)后6d），BCP組和MT組大鼠患側(cè)PWT均明顯低于Sham組大鼠（P＜0.01）。嗎啡注射第1d，MT組大鼠患側(cè)PWT顯著高于BCP組大鼠（P＜0.01）；嗎啡連續(xù)注射11d（術(shù)后17d）后MT組大鼠PWT下降至BCP組大鼠同等水平（P＞0.05）。嗎啡耐受前介入電針干預(yù)后第9d～13d（即術(shù)后第15d～19d），EA I組大鼠PWT明顯高于MT組大鼠（P＜0.05或P＜0.01）；而術(shù)后第20d 至24d，EA I組大鼠PWT與MT組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。嗎啡耐受后介入電針治療第1d～7d，EA II組大鼠患側(cè)PWT較MT組和ShamEA組均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。[結(jié)論]骨癌痛大鼠給予腹腔連續(xù)注射嗎啡11d時，即可成功誘導(dǎo)癌痛大鼠嗎啡耐受模型；嗎啡耐受前給予電針預(yù)刺激可延緩骨癌痛大鼠嗎啡耐受產(chǎn)生；嗎啡耐受后給予電針治療可部分翻轉(zhuǎn)骨癌痛大鼠嗎啡耐受效應(yīng)。

骨癌痛；嗎啡耐受；電針；干預(yù)時間；療效

據(jù)統(tǒng)計，骨轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生率占乳腺癌、肺癌、前列腺癌等原發(fā)惡性腫瘤的30%～80%[1]，其中乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高達70%～80%[2]。骨轉(zhuǎn)移癌可引起劇烈疼痛，甚至發(fā)生病理性骨折，嚴重影響晚期癌癥患者的生存質(zhì)量。嗎啡是臨床治療重度癌痛的“金標準”藥物，但長期使用易產(chǎn)生嗎啡耐受[3]（嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)減弱，需增加藥物劑量才能達到有效的鎮(zhèn)痛作用）。嗎啡耐受不僅嚴重限制了嗎啡在臨床的使用率，而且也是晚期癌痛難以控制的主要原因。目前針灸治療癌痛已成為美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national comprehensive cancer network，NCCN）發(fā)布的腫瘤臨床實踐應(yīng)用指南——NCCN癌癥治療指南，并取得較好的鎮(zhèn)痛療效

[4]。但電針在癌痛大鼠嗎啡耐受治療領(lǐng)域研究甚少，尤其對嗎啡耐受有關(guān)針刺介入時間與干預(yù)效應(yīng)的研究至今無報道。本研究欲探討不同時間介入電針刺激對癌痛-嗎啡耐受的療效評估，以期為臨床治療時機提供相應(yīng)依據(jù)并明確電針對癌痛嗎啡耐受不同階段的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組清潔級健康雌性SD大鼠53只，體質(zhì)量150～180g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間給予嚙齒動物標準顆粒飼料和飲水，12h循環(huán)燈光，恒溫20～24℃，恒濕50%～70%。所有實驗大鼠處置均符合科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。動物許可證編號SCXK（滬）2013-0016。將實驗大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組（文中用Sham表示），10只；骨癌痛組（文中用BCP表示），8只；骨癌痛-嗎啡耐受組（文中用MT表示），8只；電針Ⅰ組（文中用EA I表示），8只；電針Ⅱ組（文中用EA II表示），8只；假電針組（文中用ShamEA表示），11只。

1.2 實驗試劑及儀器Walker256大鼠乳腺癌細胞株（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，3111C0001CCC-000316），鹽酸嗎啡注射液（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，130105-1），RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，1744359），胎牛血清（美國Gibco公司，1527494），青霉素－鏈霉素溶液（碧云天生物技術(shù)研究所，C0222），0.25%胰酶（美國Gibco公司，1676922），無菌骨蠟（美國強生公司，W810T）。細胞計數(shù)儀（美國BioRed公司，TC10），臺式低速離心機（上海Anke公司，TDL-60C），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，3111），顯微鏡（德國徠卡公司，DM2500），動態(tài)足底測量儀（意大利UGO BASILE公司，37450），韓式電針儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司HANS-200A），針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠，華佗牌，Φ0.25mm×13mm）。

1.3 骨癌痛-嗎啡耐受大鼠模型

1.3.1 Walker256大鼠乳腺癌細胞制備將液氮中凍存的Walker256細胞進行復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)。將細胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青-鏈霉素）培養(yǎng)7d。造模當(dāng)天對培養(yǎng)瓶中懸浮生長的細胞用無菌PBS液清洗，1200r/min離心3min，收集細胞懸液，細胞計數(shù)板讀數(shù)后配制成濃度為1×107cells/mL的細胞懸液，置于冰上備用。

1.3.2 模型建立所有實驗大鼠術(shù)前禁食1d，手術(shù)當(dāng)天采用10%水合氯醛溶液以0.35mL/100g腹腔注射麻醉后，左腿備皮消毒，距膝關(guān)節(jié)下約2cm處切開皮膚，暴露脛骨。除Sham組大鼠外，其余5組大鼠均參照文獻[5-6]制備骨癌痛，采用10μL微量注射器將Walker256大鼠乳腺癌細胞懸液10μL（1×105細胞）緩慢注射于左脛骨髓腔內(nèi)，無菌骨蠟封孔，無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗，縫合后，肌注0.2 mL青霉素鈉溶液。Sham組大鼠僅注入等量的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）10μL。于術(shù)后7d，將MT組、EAI組、EAII組、Sham EA組骨癌痛制備成功大鼠每日以10mg·kg-1的劑量腹腔注射鹽酸嗎啡注射液（10mg·mL-1），每12h注射1次（早上9：00，晚上9：00），連續(xù)注射11d，以大鼠機械縮足閾（paw withdrawal thresholds，PWT）下降約50%～70%（即機械痛覺過敏）為骨癌痛及癌痛-嗎啡耐受成功的指標。

1.4 分組處理Sham組及BCP組：術(shù)后不給予任何處理。MT組：骨癌痛-嗎啡耐受模型制備成功后，仍給予10mg·kg-1的劑量腹腔注射鹽酸嗎啡注射液（10mg·mL-1），每12h注射1次（早上9：00，晚上9：00），連續(xù)注射至術(shù)后第24d。EA I組：于術(shù)后第7d開始給予嗎啡腹腔注射（10mg·mL-1），每12h注射1次（早上9：00，晚上9：00），且于上午9:00嗎啡注射0.5h后介入電針治療，采用2/100Hz電針，取雙側(cè)“足三里”和“昆侖”穴，0.5mA～1.5mA，每10min遞增0.5mA，30min/次，1次/d，直至術(shù)后第24d。EA II組：于骨癌痛-嗎啡耐受模型制備成功之后開始介入電針治療，即術(shù)后第18d仍給予嗎啡注射（注射劑量及時間同MT組），且于上午9：00嗎啡注射0.5h后介入電針治療，電針刺激參數(shù)同EAI組，連續(xù)治療7d。ShamEA組：于骨癌痛-嗎啡耐受模型制備成功之后開始介入假電針治療，即術(shù)后第18d仍給予嗎啡注射（注射劑量及時間同MT組），且于上午9：00嗎啡注射0.5h后僅給予針刺破皮，不通電治療，其穴位及治療時間同EAII組。

1.5 大鼠PWT檢測分別在Walker256癌細胞接種前1d（base），術(shù)后第6至24d檢測各組大鼠PWT（圖1）。將大鼠置于鐵絲網(wǎng)上11.5×17×14cm大小的透明有機玻璃箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，待大鼠安靜后（停止理毛和行為探索，約15min），將儀器上的直徑約0.5mm的細絲對準大鼠左側(cè)足底（4個足墊空隙之間），以2.5g/sec刺激，最大刺激量為50g，刺激后大鼠快速縮足為陽性反應(yīng)，大鼠縮足時的力量（單位：g）即為其PWT。每只大鼠測量5次，每次間隔3～5min，去掉最大值和最小值取其平均值即為PWT。

圖1 實驗操作流程示意圖Fig.1 The sketch map of flow of experimental operation

2 結(jié)果

2.1 骨癌痛大鼠PWT變化和嗎啡耐受出現(xiàn)時點癌細胞接種術(shù)前（base），Sham組、BCP組及MT組大鼠之間患側(cè)PWT比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。術(shù)后第6d，與Sham組大鼠比較，BCP組與MT組大鼠患側(cè)PWT均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示骨癌痛手術(shù)成功。術(shù)后第7d（即嗎啡注射第1d），MT組大鼠患側(cè)PWT為48.29±0.97g，均顯著高于BCP組和Sham組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。隨著嗎啡連續(xù)注射，MT組大鼠患側(cè)PWT呈逐漸下降趨勢。至術(shù)后第17d（即嗎啡注射第11d），MT組與BCP組大鼠比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；但MT組、BCP組大鼠患側(cè)PWT分別與Sham組大鼠比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），此時骨癌痛大鼠嗎啡耐受產(chǎn)生。見圖2。

2.2 電針預(yù)刺激可延緩骨癌痛大鼠嗎耐受產(chǎn)生課題組觀察到術(shù)后第17d，MT組大鼠產(chǎn)生嗎啡耐受（圖2）。嗎啡耐受前（術(shù)后第7d）進行電針干預(yù)刺激，術(shù)后第15d～第19d（即電針干預(yù)后第9d～第13d）EAI組大鼠PWT開始明顯高于MT組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。術(shù)后第20～24d，EA I組大鼠PWT與MT組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即EAI組大鼠嗎啡耐受產(chǎn)生，說明提前介入電針干預(yù)可延緩嗎啡耐受的產(chǎn)生。見圖3。

圖2 骨癌痛-嗎啡耐受大鼠PWT變化Fig.2 The change of PWT of bone cancer pain and morphine tolerance rat

圖3 嗎啡耐受前電針干預(yù)后大鼠的PWT變化Fig.3 The change of PWT of rat with electroacupuncture intervention before morphine tolerance

2.3 電針治療可部分翻轉(zhuǎn)骨癌痛大鼠嗎啡耐受MT組、EA II組、ShamEA組大鼠在接種術(shù)前（base）、術(shù)后第6d、7d至17d各個時間點PWT，三組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。電針治療第1d（術(shù)后18d），EA II組大鼠PWT為32.87±4.86g，同MT組和ShamEA組大鼠比較均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；同樣電針治療第2d、5d、7d，EA II組大鼠PWT仍明顯高于其他兩組大鼠（P＜0.01或P＜0.05）。而ShamEA組大鼠見各個時間點PWT與MT組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 電針對骨癌痛-嗎啡耐受大鼠機械縮足閾影響Fig.4 Effect of electroacupuncture on the PWT of bone cancer pain and morphine tolerance rat

3 討論

目前癌痛患者普遍存在阿片耐受與痛覺過敏現(xiàn)象，以嗎啡為代表的阿片類藥物依賴及鎮(zhèn)痛耐受發(fā)生率高達35%～57%[7]。痛覺過敏是一種常見的臨床現(xiàn)象，以疼痛閾值降低和傷害性刺激的敏感性增強為特征[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，圍術(shù)期應(yīng)用阿片類藥物可引起機體對正常痛刺激的反應(yīng)性增高，導(dǎo)致阿片類藥物鎮(zhèn)痛效應(yīng)的敏感性降低，出現(xiàn)反常性疼痛，即阿片類藥物誘發(fā)的痛覺過敏（opioid-induced hyperalgesia，OIH）[9-10]。目前，國內(nèi)外對阿片耐受形成的驗證均采用痛覺過敏的檢測[11-12]。

常見骨癌痛模型接種的癌細胞主要集中于溶骨性NCTC2472纖維肉瘤細胞、MRMT-1乳腺癌細胞、AT-3.1前列腺癌細胞、Walker256乳腺癌細胞及Lewis肺癌細胞[13]。本研究將Walker256乳腺癌細胞注入大鼠脛骨髓腔內(nèi)，制備轉(zhuǎn)移性骨癌痛，結(jié)果顯示W(wǎng)alker256乳腺癌細胞接種6d后，BCP組大鼠機械縮足閾較Sham組相比顯著下降（P＜0.01），表明骨癌痛制備成功，與以往研究報道的機械痛敏時間相符[5]。骨癌痛大鼠以每天10mg·kg-1的劑量嗎啡腹腔連續(xù)注射11d，2次/d，發(fā)現(xiàn)嗎啡注射第1d時MT組大鼠PWT高達48.29±0.97g，說明嗎啡即刻鎮(zhèn)痛作用明顯，但連續(xù)腹腔注射嗎啡11d后大鼠機械痛閾下降至同期骨癌痛組水平，此時嗎啡鎮(zhèn)痛無效，說明大鼠機械痛覺過敏，即癌痛嗎啡耐受模型建立，與以往研究結(jié)果較為相似[14]。張亞軍等[15]采用Walker256乳腺癌細胞注入大鼠脛骨髓腔內(nèi)后再行鞘內(nèi)注射嗎啡（20μg· kg-1，2次/d）連續(xù)9d，同樣建立骨癌痛-嗎啡耐受模型。由于嗎啡給藥途徑不同，而鞘內(nèi)給藥后誘導(dǎo)的癌痛-嗎啡耐受發(fā)生的時間點相對較早。但本實驗認為鞘內(nèi)給藥直接造成大鼠2次手術(shù)傷害，易增加大鼠死亡率，采用腹腔注射方式對大鼠傷害性小。

電針鎮(zhèn)痛（electroacupimcture,EA）是一種有效的鎮(zhèn)痛方法，可以有效地治療各種急、慢性炎性痛和癌痛。有研究發(fā)現(xiàn)，電針鎮(zhèn)痛有著穴位特異性，雙側(cè)足三里電針刺激可明顯延長縮爪時間，而手三里和內(nèi)關(guān)穴無此類似作用[16]。刺激“足三里”穴而非“腎俞”穴可減緩嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，逆轉(zhuǎn)嗎啡行為敏化形成[17]，本研究選大鼠雙側(cè)“足三里”和“昆侖”穴作為骨癌痛-嗎啡耐受大鼠電針鎮(zhèn)痛的穴位。此兩個穴為具體參照《大鼠穴位圖譜研制》[18]，足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5mm處，昆侖穴位于后肢外踝與跟腱之間的凹陷中。

研究認為，電針通過促進內(nèi)源性阿片肽的釋放或激活阿片受體以發(fā)揮其鎮(zhèn)痛的作用[19]，不同的電針頻率對電針鎮(zhèn)痛效果起不同的作用。研究已表明，2Hz電針主要激活腦啡肽、內(nèi)啡肽和內(nèi)嗎啡肽，作用于μ 和δ阿片受體而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛，100Hz電針激活強啡肽作用于κ阿片受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛[20-21]。2/100Hz電針均可激活μ、δ及κ三種阿片受體類型發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)[22-23]。有實驗證明，2/100Hz經(jīng)皮刺激于應(yīng)用嗎啡的患者，可以降低其嗎啡耐受的發(fā)生幾率[24]。鄭宇欣等[25]采用2/ 100Hz電針可以延緩炎性痛大鼠嗎啡耐受的產(chǎn)生。

本實驗中，2/100Hz電針刺激雙側(cè)足三里和昆侖穴可增強嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。EA I組于術(shù)后第7d（嗎啡耐受前）給予電針干預(yù)刺激，在電針干預(yù)后第9d（即術(shù)后第15d），EA I組大鼠PWT高于同期MT組大鼠（P＜0.05），一直持續(xù)至術(shù)后第19d。而于術(shù)后20d，EAI組與同期MT組大鼠PWT無差異，提示此時，EAI組大鼠嗎啡耐受產(chǎn)生，表明電針預(yù)刺激可以延緩嗎啡耐受出現(xiàn)，但不能完全阻止其出現(xiàn)。于嗎啡耐受后（術(shù)后18d）介入電針治療1周，電針治療后1～7d，EA II組大鼠PWT均顯著高于同期MT組和ShamEA組大鼠（P＜0.05或P＜0.01），說明電針治療能提高骨癌痛-嗎啡耐受大鼠的機械痛閾，具有翻轉(zhuǎn)嗎啡耐受作用。

綜上所述，提前介入電針干預(yù)可延緩骨癌痛嗎啡耐受的產(chǎn)生，而嗎啡耐受后介入電針治療能夠拮抗嗎啡耐受效應(yīng)，但電針翻轉(zhuǎn)嗎啡耐受是否呈持續(xù)性或周期性變化及相關(guān)機制，還有待進一步研究。

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Analgesia Effect of Electroacupuncture at Different Time on Morphine Tolerance in Rats with Bone Cancer Pain

FU Taofang,DU Junying,CHEN Yitian,et al The Third Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medicine University,Hangzhou(310053),China

[Objective]Investigating the characteristic of morphine tolerance model in rats with bone cancer pain induced by Walker 256 breast cancer cell and observating the therapeutic effect of electroacupuncture(EA)at different time on morphine tolerance.[Methods]The 53 SD rats were randomly divided into 6 groups:sham group(Sham),bone cancer pain group(BCP),bone cancer pain+morphine tolerance group(MT),EA I group(EAⅠ),EA II group(EAⅡ),ShamEA group(ShamEA).The 10μL Walker 256 breast cancer cells(1×105)were injected into left tibial bone marrow cavity of rat.At 7 days after surgery,the successful preparation of bone cancer pain in rats by intraperitoneal injecting morphine hydrochloride continuous 11d(10mg·kg-1,q12h)to induce morphine tolerance.Before morphine tolerance(Seventh day after operation),rats in EA I group were treated with electroacupuncture,which had been lasted for 18 days.The first day after morphine tolerance,rats in EA II group were involved in EA treatment,continuing for 7 days.EA was applied to bilateral“Zusanli”(ST36)and“Kunlun”(BL60).Rats in Sham EA group were only given acupuncture to break the skin,and no electricity,the acupoint and treatment time were consistent with EA II group.Observing the changes of PWT to evaluate the effect of EA.[Results]After 6 days of the cancer cells were inoculated,the PWT of the BCP group and MT group was significantly lower than that of the Sham group(P＜0.01).The first day after morphine injection,the PWT of MT group was significantly higher than those of the BCP group(P＜0.01).With morphine for 11 consecutive days(17 days after operation),the PWT of MT group was decreased to the same level of the BCP group(P＞0.05).At 9d to 13d after EA intervention,the PWT of EA I group was significantly higher than those of MT group(P＜0.05 or P＜0.01),before the morphine tolerance established.To 20 days after operation,there was no significant difference between the EA II group and MT group(P＞0.05).After the model of morphine tolerance was established,at 1d to 7 days after EA analgesia,the PWT of EA II group was significantly higher than those of MT group and Sham EA group(P＜0.05 or P＜0.01).[Conclusion]With the intraperitoneal injection of morphine for 14 days,the model of bone cancer pain rat and morphine tolerance can be established.Early intervention of EA stimulation before the formation of morphine tolerance could delay it in rats with bone cancer pain.EA stimulation after the formation of morphine tolerance could partially reverse it in rats with bone cancer pain.

bone cancer pain;morphine tolerance;electroacupuncture;intervention time;therapeutic effect

R245.9

A

1005-5509（2017）06-0447-07

10.16466/j.issn1005-5509.2017.06.001

2016-12-12）

國家自然科學(xué)基金（81102643）；浙江省自然科學(xué)基金（LY14H270016，LQ15H270003）；中國博士后基金面上項目（2014M550334）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目（2014KYA162）

Fund projects:National Natural Science Foundation of China(81102643)；Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(LY14H270016,LQ15H270003)；China Postdoctoral Science Foundation on General Financial Grant Program（2014M550334）；Zhejiang Provincial Medical and Health Research Program（2014KYA162）

梁宜，E-mail：liangyiwww@126.com