一株副豬嗜血桿菌的分離與鑒定

寧慧波，陳同煜，曾容愚

[1.海博萊生物科技咨詢（北京）有限公司，北京 海淀 100086；2.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271000]

一株副豬嗜血桿菌的分離與鑒定

寧慧波1，陳同煜2，曾容愚1

[1.海博萊生物科技咨詢（北京）有限公司，北京 海淀 100086；2.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271000]

華東某豬場發生了以仔豬發燒、咳嗽、關節腫大、食欲廢絕為特征的傳染病，給豬場帶來了很大的經濟損失。通過病理剖檢和實驗室診斷確定此次疫情是由副豬嗜血桿菌感染引起的，通過藥物治療等一系列綜合防控措施，豬場狀況得到了明顯改善，提高了豬群成活率和經濟效益。目前，該豬場已恢復正常生產。

豬；副豬嗜血桿菌；診斷；藥敏試驗；防治

豬副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS） 引起的豬的一種高致病性傳染性疾病，也稱格拉瑟氏病（Gl?sser's disease）[1]。主要危害 2 周齡至 4 月齡的豬，5～8 周齡仔豬多發。發病率在 10%～15%，有窩發特點，死亡率可高達 50%以上。臨床上表現為胸膜炎、腹膜炎、心包炎、肺炎、關節炎及腦炎等[2-4]。

副豬嗜血桿菌通常作為常在菌群定居在健康豬的上呼吸道，與豬的免疫系統保持著脆弱的平衡狀態。但斷奶、長途運輸、混群、豬舍溫度和濕度不當等應激因素均可打破這種平衡，使副豬嗜血桿菌遷移到下呼吸道和肺，繼而通過敗血癥蔓延到全身，導致該病的暴發[1-5]。另一方面，在藍耳病、偽狂犬病、圓環病毒病、豬流感等病毒性疾病造成的繼發感染病例（呼吸道病綜合征）中，副豬嗜血桿菌是主要病原之一，也是導致豬群死亡率和發病率增加的主要因素[6-9]。所以，副豬嗜血桿菌憑借 單獨感染或參 與產生呼吸道病綜合征，成為豬場揮之不去的頑疾。

副豬嗜血桿菌病暴發時可以用抗生素來控制。但是，口服或肌注的抗生素必須在癥狀出現的早期使用才有效果。臨床癥狀明顯比如生長緩慢和被毛雜亂的仔豬，往往對抗生素治療不敏感。而且，一旦該菌進入了漿膜、關節、腦組織后，抗生素就更加難以發揮作用[1-5]。大量田間數據顯示，疫苗預防越來越成為防控該病的最經濟最有效的手段[10-12]。

1 發病豬場背景

華東某養豬集團生產純種長白、大白母豬。其中 A 場為繁育核心場，規模為 800 頭；B 場為擴繁場，規模為 1 000 頭；C 場為商品豬場，規模為 1 100頭。2016 年 3 月，C 場部分仔豬陸續出現呼吸困難、體溫升高、食欲廢絕、關節腫大等癥狀，發病率達10%，同時伴有豬只死亡的情況，采取多種治療措施，療效不佳。筆者了解到由于選育及場舍原因，該場半月前從B場運入部分仔豬，期間氣溫突降，而后豬群陸續出現上述情況，并且愈發嚴重，病情已經持續近半個月。但母豬及肥豬群較為正常。

2 臨床癥狀

病豬體溫升高在 40.1～41.5 ℃，咳嗽、腹式呼吸，扎堆（圖 1），消瘦（圖 2），被毛粗亂，耳尖發紺壞死（圖 3），關節腫大，步態不穩（圖 4）。

圖1 扎堆

圖2 消瘦

圖3 耳尖發紺壞死

圖4 關節腫大，步態不穩

3 剖檢病變

腫脹關節皮下呈膠凍樣變，關節腔內有漿液性炎性滲出液（圖 5）；腹股溝淋巴結腫大，切面呈灰白色（圖 6）；胸腔及腹腔有大量炎性滲出液，心包積液（圖 7）；心外膜與心臟粘連在一起，形成“絨毛心”狀（圖 8）；腹腔內臟器官粘連，呈現纖維性腹膜炎（圖9）；肝臟表面覆有一層干酪樣滲出物，形成肝周炎（圖 10）。

圖5 關節腔內有漿液性炎性滲出液

圖6 腹股溝淋巴結腫大

圖7 胸腔及腹腔有大量炎性滲出液，心包積液

圖8 絨毛心

圖9 腹腔內臟器官粘連，呈纖維性腹膜炎

圖10 肝臟表面覆有一層干酪樣滲出物

4 實驗室診斷

4.1 細菌分離鑒定結果

4.1.1 細 菌 分 離 培 養 無菌采集患豬心包液、關節液等分別接種于血瓊脂培養基，37 ℃ 恒 溫 培 養 48 h，挑取可疑單個菌落進行純培養。結果顯示，血瓊脂培養基上有許多邊緣整齊、圓形隆起小菌落，半透明、灰白色、光滑、針尖大小、露珠樣菌落，不溶血（圖 11）。

4.1.2 涂片、鏡檢 挑取菌落涂片，經革蘭氏染色、鏡檢可見大量細長絲狀、大小不一的革蘭氏陰性短小桿菌（圖 12）。

圖11 細菌培養菌落

圖12 分離菌株革蘭氏染色結果（1 000×）

4.2 組織病理學檢測結果

對剖檢豬的腦、肺臟、肝臟、心臟采樣，用 10%中性福爾馬林溶液固定，常規方法制作石蠟切片，HE 染色，鏡檢。可見腦呈典型化膿性腦炎病變，滲出的中性粒細胞崩解破碎，小膠質細胞彌漫性增生，在血管周圍中性粒細胞和淋巴細胞浸潤形成管套（圖 13-A）。肺臟氣腫，肺泡腔增大，肺泡壁變薄，支氣管黏膜上皮崩解破碎脫落（圖 13-B）。肝臟表面纖維素性滲出區和肝臟小葉大量炎性細胞浸潤，中央靜脈充血，肝細胞彌漫性壞死（圖 13-C）。心臟間質毛細血管充血、局部出血，結締組織增生，炎性細胞浸潤（圖 13-D）。

圖13 組織病理學檢測結果

4.3 PCR 檢測結果

參照 O liveira 等（2001）的報道方法合成引物：上游引物 P1：5'-TGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'，下游引物 P2：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'，預擴增片段大小為 821 bp。反應體系 25 μL：10×Taq Buffer 10 μL，10 μLWater，3 μL 菌液模板，上下游引物（濃度 10 μmol/L）各 1 μL。反應條件為 94 ℃預變性5min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1min，30 個循環；1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，見圖 14。結合流行情況、臨床癥狀、病理剖檢及實驗室檢測確定該場為HPS感染發病。

圖14 PCR 檢測結果

5 藥敏試驗

對分離菌株進行藥敏試驗，結果顯示，分離菌株對丁胺卡那霉素、強力霉素、環丙沙星高度敏感，對頭孢噻呋鈉、泰樂菌素中度敏感，對林可霉素、氟苯尼考、替米考星不敏感（表 1）。

表1 分離菌株藥敏試驗結果 mm

6 防治方案

6.1 隔離封鎖、嚴格消毒

無害化處理病死豬和排泄物。為防止疾病傳播，及時將病豬與健康豬隔離飼養。對發病嚴重、極度消瘦的豬放棄治療。對發病欄舍徹底清洗，再用2%氫氧化鈉水溶液噴灑地面和墻壁。全場使用0.2%過氧乙酸溶液帶豬噴霧消毒，每天 1 次，連續1周。對外來車輛在指定地點進行徹底清洗、消毒。

6.2 加強飼養管理

杜絕不同日齡的豬混養于一欄，根據豬只生長階段合理調控飼養密度。加強豬舍的通風換氣、保持圈舍干燥。飲水中添加新胺基維他（液體維生素和氨基酸），200 mL/t，連用 7 d，以補充生長所需維生素及氨基酸，減少運輸、混群、換料等應激。

6.3 藥物防治

對未發病豬群進行全群投藥，每噸飼料添加丁胺卡那霉素 200 g，黃芪多糖 300 g，連用 7 d。

6.4 對癥治療

對癥狀明顯的豬只使用丁胺卡那霉素 10mg/kg體重，肌肉注射，每天 2 次，連用 3 d；輔助使用喜炎凈（5%氟尼辛葡甲胺）0.44 mL/kg 體重，進一步增強解熱鎮痛消炎及抗內毒素的效果。

采取上述綜合措施 1周后，豬群發病情況逐漸減輕；1 個月后豬群逐漸恢復正常生產，保育豬成活率接近 97%。

7 診治體會

7.1 現代養豬管理模式不能解決副豬嗜血桿菌高度感染問題

盡管養豬產業逐漸走向規模化、現代化，但是在我國由于免疫抑制疾病如圓環病毒病、藍耳病、偽狂犬病、喘氣病等疾病的普遍存在，作為豬場常在菌與條件性致病菌的副豬嗜血桿菌，在豬群受到應激如天氣變化、斷奶、轉群、發生疾病時常常作為并發疾病或繼發疾病存在，給豬場的疾病防控帶來很大的困難，也是造成當前豬場因疾病損失的主要原因之一[13-14]。

7.2 臨床診斷需做好與其他疾病的鑒別診斷

當前豬場疫病越來越復雜，加之副豬嗜血桿菌病常繼發于其他疫病，臨床癥狀又與鏈球菌病、傳染性胸膜肺炎、偽狂犬病、喘氣病等疾病極其相似不易區分，因此診斷治療時務必注意與其他疫病的鑒別，避免誤診延誤治療[15]。同時其易與藍耳病、圓環病毒病等疾病混合感染，這也加大了該病的診斷難度。對于副豬嗜血桿菌某些血清型如 3、6、7、9、11 型豬感染后無明顯癥狀，更是增加了臨床診斷的不確定性。如不能確診，可以通過細菌分離及 PCR 檢測的方法進行確診，以避免因誤診造成不必要的損失[16]。

7.3 實驗室診斷工作繁瑣

根據豬群的臨床癥狀及病理剖檢結果進行初步診斷。HPS的確診需要通過實驗室細菌分離培養、組織病理學、PCR 等方法進行。首先應選取臨床癥狀典型且未經抗生素治療的病豬，采取人工致死的方法，在病豬生前呈封閉狀態的部位，如心包、關節、腦膜等處采取新鮮病料，在24 h內進行病原分離。HPS是上呼吸道中的共棲息微生物，鑒于可以從健康動物的鼻腔、扁桃體、氣管中分離出 HPS，HPS 在肺部只引起肺炎，而引起肺炎的病原菌很多，從肺炎的肺回收到分離物未必是侵襲豬群的病原菌株，故采集 HPS 一般不使用肺組織采樣[1]。由于 HPS 易與其他敗血性細菌感染相混淆，故需進行生化試驗鑒定區分。HPS的分離培養比較困難，對培養基要求高，增加了實驗室診斷難度。

7.4 抗生素預防和治療往往得不償失

盡管可以通過藥敏試驗來篩選敏感藥物進行治療，但是由于副嗜血桿菌的致病力強，耐藥性產生快，大劑量使用該種抗生素，無形中也在促進副嗜血桿菌的進化，使其致病力越來越強，也造成該藥物的敏感程度日趨下降，最終導致疾病流行越來越嚴重，且越來越難控制。此外，副豬嗜血桿菌在死亡時會釋放內毒素，造成機體發熱，導致二次繼發感染。抗生素可以殺滅細菌，但不能抑制內毒素的生物活性。所以，副豬嗜血桿菌病的抗生素治療必須要考慮使用可以同時抑制內毒素活性的藥物[17]。

7.5 優秀的疫苗是預防此病的最有效方法之一

一般來說豬群普遍都帶有 HPS，因此將其徹底從豬群中清除是不可能的，也是沒有必要的。疫苗免疫接種可以使豬群建立起保護性免疫力。目前定型的 HPS 有 15 種，另有 20%以上的分離株不能分型[18]。我國流行的血清型以 5 型和 4 型為主，與德國、美國、澳大利亞和加拿大等國報道一致[19]。在一個豬群中出現幾個菌株或血清型并非少見，甚至在單個豬上不同部位可以分離多個菌株或血清型[10]。由于血清型多樣，選擇具有良好交叉免疫力的菌株及血清型的疫苗尤為重要[17-21]。母豬免疫不僅能夠減少仔豬上呼吸道副豬嗜血桿菌的定居數量，延遲定居的時間（從第 2 天推遲到第 7 天），而且能減少仔豬定居菌株的血清型種類[11，22]。通常情況下，母豬接種后其母源抗體可對6周內的仔豬產生保護；如再有6 周以上小豬發生該病，在免疫母豬的同時，考慮對仔豬 14 d 和 28 d 免疫兩次[10]。

8 小結

副豬嗜血桿菌是一種豬場常在菌，也是一種條件致病性疾病，豬場一旦發生豬副嗜血桿菌病，高發病率和高死亡率往往給豬場造成很大的經濟損失。控制該病必須從源頭做起，找出并消除原發病因、提高豬群免疫力，才能有效預防該病的發生。必須加強環境控制、減少應激因素、提高飼養管理水平、強化生物安全和疫苗預防相結合，盡可能從根本上減少副豬嗜血桿菌病的發生。

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（編輯：富春妮）

美一少年命喪咖啡因

【法新社美國邁阿密 5月 17日電】事實證明，對南卡羅來納州的一名少年而言，一杯咖啡、一份添加咖啡因的飲料和一份能量碳酸飲料是一個致命組合。他在喝下這些飲料兩個小時之后死亡，提醒人們重視過量攝入咖啡因的風險。

該州里奇蘭縣驗尸官辦公室發布聲明稱，戴維斯·艾倫·克里普 4 月 26 日死于“咖啡因引發的心臟病，很可能是心律失常”。

驗尸官加里·沃茨 16 日指出，發生此種事“極不尋常”。

他對記者說：“主要是因為他攝入這些咖啡因的速度太快，影響了他的心臟。”他還說，克里普在喝下能量飲料后僅15分鐘就垮掉了。

美國食品和藥物管理局建議，成人每天攝入咖啡因不超過 400 毫克，相當于四到五杯咖啡。

帕爾梅托中毒研究中心的吉爾·米歇爾斯發布聲明說：“成年人應該關注自己的咖啡因攝入量，而父母則應該了解兒童和青少年攝入咖啡因的風險。”

（轉自 參考消息[N]，2017-05-18）

S858.282.61+2

A

1002-1957(2017)03-0097-04

2017-03-17

寧慧波（1982-），男，山東蓬萊人，執業獸醫師，在讀博士研究生，主要從事規模化豬場生產管理及豬病防控工作.

E-mail:nhb593831@163.com