ε-聚賴氨酸對公豬精液中常見細菌的體外抑制效果研究

謝景興，劉兆軍，魏 寧，侯震坤，楊公社，龐衛軍

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西 咸陽 712100）

ε-聚賴氨酸對公豬精液中常見細菌的體外抑制效果研究

謝景興，劉兆軍，魏 寧，侯震坤，楊公社，龐衛軍

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西 咸陽 712100）

試驗首先采用高通量測序法檢測常溫保存 1、3、5 d 關中黑豬精液細菌的種類及所占比例，而后采用 16S rDNA 法初步鑒定精液中分離的部分細菌，并篩選出精液中常見細菌作為 ε-聚賴氨酸體外抑菌試驗菌種，最后探究 0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 g/L 的 ε-聚賴氨酸對精液中常見細菌的抑制作用。結果表明，在常溫保存過程中革蘭氏陰性菌為優勢菌群，且 0.04 g/L 的 ε-聚賴氨酸能有效抑制大腸桿菌、表皮葡萄球菌和魯菲不動桿菌的生長。因此，在常溫保存過程中添加 ε-聚賴氨酸能有效控制精液中常見細菌的生長。

ε-聚賴氨酸；公豬精液；細菌

公豬精液主要受到動物源和非動物源的細菌污染，動物源的細菌主要來自公豬的糞便、包皮積尿、呼吸道分泌物、生殖道、皮膚和毛發，而非動物源的細菌主要來自污染水源、未滅菌的玻璃器皿、精液稀釋設備及采精、精液稀釋的工作人員等[1]。近年來在精液中分離到的細菌大約有 25 種左右，其中以腸桿菌科類的細菌居多[1-2]。王健[3]發現公豬精液中主要的細菌有鹽單胞菌屬、不動桿菌屬、葡萄球菌屬等。蘇澤智[4]研究發現精液中的細菌主要為大腸桿菌、葡萄球菌、變形桿菌等。金穗華等[5]從精液中分離鑒定出 7 種含量較多的細菌，主要為棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌、不動桿菌屬等。張家慶等[6]在廣西地區的公豬精液中主要分離到大腸桿菌、克雷伯菌、變形桿菌等。從上述研究結果可知細菌普遍存在于公豬精液中，且不動桿菌屬、葡萄球菌、大腸桿菌在以上研究結果中出現頻率較大，說明這幾種細菌在公豬精液中較常見，可優先作為藥敏性試驗菌種。

目前主要通過在精液中添加抗生素用以抑制細菌的生長，以延長公豬精液的保存時間。然而，由于抗生素的不合理使用，致使部分細菌對常規抗生素產生耐藥性。如今，細菌耐藥性問題已成為世界各國不得不面對的公共衛生問題。而畜牧業是抗生素濫用的“重災區”。為減少抗生素的使用，出現了很多新型抗菌物質。目前，研究較多的是陽離子天然的抗菌劑，如乳酸鏈球菌素、納他霉素等。但這些天然抗菌物質對革蘭氏陽性菌（G+） 和霉菌的抑制效果較好，而對革蘭氏陰性 菌（G-）的抑制效 果不太理想[7]。而污染公豬的細菌主要為 G-菌[8]。因此，應選擇對于G-抑菌效果好的抗菌物質。

ε-聚賴氨酸（ε-PL）是一種由 25～35 個相同賴氨酸殘基構成的天然陽離子抗菌肽，溶解性大，安全無害，對 G+和 G-菌均有良好的抑制效果[9-10]。其抑菌機理是利用自身攜帶的正電荷結合到帶負電荷的菌體膜上，使菌體膜變成空洞狀，從而影響細菌正常的生命活動以實現抑菌作用，當該物質進入人體時能夠在相關酶的作用下，轉化為人體所必須的賴氨酸[11]。張偉娜[12]發現 ε-PL 能有效抑制食品中常見金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的生長。李宇雄等[13]研究發現ε-PL 能有效抑制人體尿液中常見的細菌（金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌）的生長，其最小抑菌濃度（MIC）為 0.04 g/L。基于以上研究結果，本試驗選擇從關中黑豬公豬精液中分離的幾種細菌和對公豬精子危害最大的大腸桿菌作為ε-PL 體外抑菌試驗的菌種，探究不同濃度的 ε-PL對這幾種細菌的體外抑制效果，為 ε-PL 在關中黑豬精液常溫保存中的添加量提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 公豬精液 于 2016 年 9 月 1 日開始采集來源于西北農林科技大學畜牧生產實踐基地成年健康關中黑豬公豬的精液用于本試驗。徒手采精法采精后，用 BTS 液（葡萄糖：37.15 g；檸檬酸鈉：6.00 g；EDTA：1.5 g；碳酸氫鈉：1.5 g；KCl：0.75 g） 稀釋精液，精液分裝，放入保溫箱后迅速帶回西北農林科技大學動物科技學院脂肪沉積與肌肉發育實驗室。

1.1.2 試驗菌種 魯菲不動桿菌、表皮葡萄球菌從公豬稀釋精液中分離，大腸桿菌由西北農林科技大學動物科技學院消化道與乳腺生物學實驗室惠贈。1.1.3 主要試劑 DP025，臺灣捷恩麥克的，細菌基因組 DNA 提取試劑盒（BacteriaGenomicDNAPurification Kit,50r），PCR 擴增試劑 Taq 酶，dNTPs（25mM each），DNAmaker（DL 2 000），ε-多聚賴氨酸（95%國產分析純）由上海源葉生物科技有限公司生產，草酸銨結晶紫染色液，由索萊寶生物科技有限公司生產。

1.1.4 主要儀器 無菌操作臺，PCR 儀，離心機，CASA（精子計算機輔助分析儀），光學顯微鏡，37 ℃搖床培養箱，紫外分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同保存時間段精液中微生物的測定 將用BTS 稀釋后常溫保存 1、3、5 d 的關中黑豬公豬精液送北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序。檢測不同保存時間段的關中黑豬公豬精液中的菌屬，及各個菌屬所占的比例。

1.2.2 精液中病原細菌的分離 在無菌操作臺內，取 BTS 液稀釋的公豬精液 10 μL 均勻涂抹于固體培養基表面。放入 37 ℃培養箱中，37 ℃培養 12 h后，挑取形態不同的單個菌落于 10mL 裝有液態培養基離心管中，將離心管放入 37℃搖床培養箱內，37 ℃搖床培養 24 h。

1.2.3 細菌的保種及革蘭氏染色

（1）保種。

在無菌操作臺內分別取 800 μL 菌液與 400 μL甘油于冷凍管內均勻混合后，將冷凍管存放于-80 ℃冰箱內保存以供需要時使用。

（2）革蘭氏染色。

按試劑盒使用說明操作。

1.2.4 16S rDNA 的克隆及序列測定 將菌液提取染色體 DNA，用引物 AD007 和 AD008 進行 PCR 擴增，擴增體系 50 μL：上游引物 2 μL（10mmol），下游引 物 2 μL（10 mmol），模 版 1 μL（約 50 ng），2 ×Taq PCRMastermix 25 μL，超純水 20 μL。擴增條件：94 ℃，5min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，90 s；重復 2～4步驟，進行 29 個循環；72 ℃，10min。將擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，以引物 AD007 和AD008 進行測序（表 1）。將測序所得序列輸入 NCBI數據庫比對。選擇同源性高的細菌，使用 MEGA 7.0構建進化樹，初步鑒定該細菌的菌屬。

表1 引物序列

1.2.5 比濁法測定 ε-聚賴氨酸的最小抑菌濃度 取0.1 g ε-PL 溶解于 1mL 的無菌水中，然后從中分別吸取 0、1、2、4、8、16、32 μL 的 ε-PL 于 10mL 的離心管中，除添加 32 μL ε-PL 外的離心管其余的 6 個管均用無菌水稀釋至 32 μL。而后用液體 LB 培養基稀釋至 10mL，配制成含有 0、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32g/L ε-PL 的液體培養基。然后在每個離心管內添加10 μL 的菌液，在 17 ℃恒溫箱內培養 5 d 后，用紫外分光光度計在 620 nm 處測量其吸光值（OD620nm）。

2 結果與分析

2.1 公豬精液常溫保存 1、3、5 d 后公豬精液中不同細菌所占比例

在常溫保存第1天精液中主要的細菌以葡萄球菌科占 24.13%、鏈球菌科占 13.39%、氣球菌科占11.84%等革蘭氏陽性菌為主。而革蘭氏陰性菌中的腸桿菌科占 17.19%、鹽單胞菌科占 3.95%、擬桿菌占 4.71%。當保存至第 3 天時，細菌所占的比例發生變化。在這個時間段 G-所占的比例升高，其中主要是腸桿菌科上升至 30.82%，而 G+所占的比例下降。當保存至第 5 天時精液中絕大部分的細菌為 G-中的腸桿菌科細菌，比例達到 97.76%，而 G+僅占很少的一部分。說明在 17 ℃常溫保存件下，革蘭氏陰性菌為優勢菌群。

2.2 精液中分離細菌的初步鑒定

將測序所得序列輸入 NCBI比對，得到不同來源的已鑒定細菌的 16SrDNA 序列，其中各個 16SrDNA序列與測序所得的序列的一致性 （identity） 均在99%以上，而目前 16S rDNA 的堿基序列的相似性已成為劃分菌屬的標準，其中屬內相似性應大于95%。而后使用 MEGA 7.0 軟件構建進化樹，其同一分支上的置信度都在 70 以上，一般而言置信度值在70 以上較為可信[14]。本試驗結果表明分離細菌樣本D 1.3 與魯菲不動桿菌的序列一致性為 99%，構建進化樹后其聚于同一分支下且置信度為 100，顯微鏡檢細菌形狀為球狀或桿狀，革蘭氏染色呈紅色，綜上所述 D 1.3 初步鑒定為魯菲不動桿菌。樣本 D 1.2與表皮葡萄球菌同聚一分支，且兩者的序列一致性為 99%，置信度為 99，顯微鏡檢細菌形狀為葡萄球狀，革蘭氏染色呈藍紫色。

2.3 ε-聚賴氨酸（ε-PL）的最小抑菌濃度（MIC）測定

OD620nm值越大說明液體 LB 培養基中細菌數量越多，0.01 g/L ε-PL 對細菌幾乎沒有抑菌效果，各細菌在該濃度下的吸光值接近于或稍微高于未添加ε-PL 組。隨著 ε-PL 濃度的增大，大腸桿菌、表皮葡萄球菌在 ε-PL 的濃度為 0.02 g/L 時 OD620nm急劇下降，說明該濃度的 ε-PL 已經起到抑菌效果，初步估計 0.02g/L ε-PL 為大腸桿菌和表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度。而在該濃度下魯菲不動桿菌的吸光值接近于對照組，說明 0.02 g/L ε-PL 對該細菌沒有抑制效果。當ε-PL 濃度為 0.04 g/L 時，OD620nm急劇下降，說明該濃度對魯菲不動桿菌已經起到抑制效果。初步估計0.04 g/L 為魯菲不動桿菌的最小抑菌濃度。

3 討論

本試驗采用高通量測序法對不同常溫保存時間段關中黑豬精液細菌檢測發現，在常溫保存第1天，精液中的細菌主要為 G+菌，G-菌僅占較少的一部分。但隨著保存時間的增加精液中的細菌占有發生了很大的變化。保存至第5天時公豬精液中絕大部分細菌為腸桿菌科細菌 （97.76%），G+菌占極少部分。王健[3]研究發現在精液的常溫保存初期（1～2 d）細菌生長緩慢，當精液保存至第3天時細菌開始呈指數的增長。當保存至第 5 天時，由于營養物質的減少細菌的生長速度放緩。因此，我們可以初步認為在精液保存的第1天后的精液中的細菌接近于原精中的細菌含量。這與王健[3]對原精中細菌高通量測序結果有所區別，這可能是由于公豬飼養環境、采精過程和精液稀釋及常溫保存環境不一樣所導致的。因此，應嚴格按采精程序采精，盡量避免在采精過程中引入細菌。而保存至第 5 天時，精液中的細菌主要為 G-中的腸桿菌科細菌，說明這類細菌在公豬精液常溫保存環境下為優勢菌群，在選擇抗菌藥物時應選擇對 G-菌有抑制效果的藥物。

大腸桿菌利用自身的結構特性結合到人精子膜的表面，損傷精子膜的表面從而降低精子活力和活率[15-16]。還有研究表明大腸桿菌還會黏附到精子的表面，損傷精子頂 體 和 質 膜[17]。本 試 驗 發 現 ε-PL 在0.02 g/L 時就能夠有效抑制精液中常見的表皮葡萄球菌和大腸桿菌的生長，但在該濃度下對魯菲不動桿菌的抑制效果不明顯，甚至有一定的促生長作用。需添加到 0.04 g/L 的濃度時才能對這種細菌起到抑菌效果。張偉娜[12]研究發現 ε-PL 是一種廣譜抑菌劑，該抗菌物質對細菌的抑制效果較好。這與本試驗的結果相似。而最小抑菌濃度有所不同，這可能是由于 ε-PL 的生產廠家、純度以及細菌的菌種不同所導致的。

4 結論

當關中黑豬精液保存至第1天時，精液中革蘭氏陽性菌占較大的比例，隨著保存時間的增加，至第5天時革蘭氏陰性菌占絕大部分。因此在實踐生產中應選擇對革蘭氏陰性菌抑制效果好的抗菌藥物用以精液的常溫保存。0.04 g/L 的 ε-PL 能夠有效抑制大腸桿菌、魯菲不動桿菌和表皮葡萄球菌的生長。

[1] Althouse GC,Lu KG.Theriogenology[J],2005,63(2):573-584.

[2] Althouse G C,Kuster C E,Clark SG,et al.Theriogenology[J], 2000,53(5):1167-1176.

[3] 王健. 蛋氨酸碘對豬精液常溫保存效果的研究[D]. 西安：西北農林科技大學，2016.

[4] 蘇澤智. 豬精液稀釋劑中抗生素的敏感性研究[D]. 西安：西北農林科技大學，2015.

[5] 金穗華，劉源遠，許國林，等. 養豬[J]，1994（1）：19-20.

[6] 張家慶，伏彭輝，毛獻寶，等. 養豬[J]，2009（6）：55-56.

[7] 吳雪麗，申亮，劉紅英. 核農學報[J]，2014（2）：278-284.

[8] Althouse G C,Wilson M E,Kuster C,et al.Theriogenology[J], 1998,50(4):535-543.

[9] 倪清艷，李燕，張海濤. 食品科學[J]，2008（9）：102-105.

[10] 施慶珊，陳儀本，歐陽友生.食品與發酵工業[J]，2005（6）：76-79.

[11] 楊云霞，裘曦. 現代食品[J]，2016（5）：37-39.

[12] 張偉娜. ε-聚賴氨酸的抑菌特性及對豬肉保鮮效果研究[D].濟南：齊魯工業大學，2013.

[13] 李宇雄，董明，郭國威，等. 中國職業醫學[J]，2017（1）：80-83.

[14] 劉志國，崔步云，王妙，等. 中國人獸共患病學報[J]，2015（8）：700-703.

[15]Agarwal J,Srivastava S,Singh M.Indian J Med Microbiol[J], 2012,30(2):141-149.

[16]Schulz M,Sanchez R,Soto L,et al.Fertil Steril[J],2010,94(2): 619-623.

[17]Piasecka M,Fraczek M,Gaczarzewicz D,et al.Am J Reprod Immunol[J],2014,72(4):348-358.

（編輯：郭玉翠）

Inhibitory Effect of ε-polylysine on Common Bacteria of Boar Semen in Vitro

XIE Jingxing,LIU Zhaojun,WEINing,HOU Zhenkun,YANG Gongshe,PANGWeijun
(College of Animal Science and Technology,Northwest A&FUniversity,Xianyang 712100,China)

The experimentwas conducted to explore the inhibitory effect of ε-polylysine on common bacteria in semen and to provide new ideas for reducing the use of antibiotics in dilutions.First,the high-throughput sequencing method was used to detect the species and proportion of semen bacteria in the black boar at room temperature for 1,3,5 days.Then,16S rDNA method was used to identify some bacteria isolated from semen and the bacteria ε-polylysine in vitro,and finally explored 0 g/L,0.01 g/L,0.02 g/L,0.04 g/L,0.08 g/L,0.16 g/L, 0.32 g/L ε-polylysine inhibits common bacteria in semen.The results showed that Gram-negative bacteria were the dominant flora during the preservation of normal temperature,and 0.04 g/L ε-polylysine could inhibit the growth of Escherichia coli,Staphylococcus epidermidis and Acinetobacter lwoffi.Therefore,the addition of εpolylysine during the preservation of the room temperature can effectively control the growth of common bacteria in semen.

ε-polylysine;semen;bacteria

S828.3

A

1002-1957(2017)03-0051-03

2017-04-24 收稿，2017-05-08 修回

國家生豬產業技術體系（CARS-36）；西北農林科技大學試驗示范站（基地）科技成果推廣項目（TGZX2015-18）

謝景興（1991-），男，福建龍巖人，在讀碩士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究工作.E-mail：xjx8513@nwsuaf.edu.cn通訊作者：龐衛軍（1972-），教授，博士生導師，研究方向為肌肉生物學與豬遺傳改良.E-mail：pwj1226@nwafu.edu.cn