激光剝蝕電感耦合等離子體質譜法中生物樣品的元素分餾效應研究

李青+張國霞+陳奕睿+汪正+丁傳賢

摘 要 采用213 nm納秒激光剝蝕系統對生物基體樣品的剝蝕顆粒進行研究，優化了激光剝蝕條件。在剝蝕能量為25%，束斑直徑為200 μm，剝蝕速率為20 μm/s，頻率為20 Hz，載氣為700 mL He + 700 mL Ar時，信號強度及穩定性最佳。以31P為內標元素，最佳剝蝕條件下，考察了56個元素的相對分餾因子。結果表明，生物基體的剝蝕顆粒相較于NIST 610 玻璃標樣更大，達到3 μm；生物基體中元素分餾效應相較于玻璃基體小，大多數元素的相對分餾因子達到1.0 ±0.1。探討了生物基體中元素分餾機理，分析了生物基體相較于玻璃基體剝蝕顆粒大，而相對分餾因子未明顯增大的原因。一方面可能是粒徑3 μm的顆粒進入電感耦合等離子體后能原子化；另一方面，大的剝蝕顆粒的富集效應相對較小。進一步對分餾效應的影響因素進行研究，發現分餾效應與激光剝蝕能量、激光頻率和掃描速率相關，并且與元素的氧化物沸點負相關，與氧化物鍵能和電離能正相關。

關鍵詞 激光剝蝕電感耦合等離子體質譜； 納秒激光； 分餾效應； 生物樣品

1 引 言

近年來，激光剝蝕電感耦合等離子體質譜法（LAICPMS） 作為一種重要的原位微區分析技術手段，具有空間分辨率高、檢出限低等特點，已廣泛應用于地球化學、冶金、生物醫藥等領域[1～4]。尤其是在生物醫藥領域，研究者采用LAICPMS研究抗癌藥物在靶器官中的分布，并將其應用到蛋白組學、金屬組學等領域[5，6]。然而LAICPMS仍面臨著巨大的挑戰——定量校準[4]。為克服這一難題，研究者建立了基體匹配[7]、內標校正[7]、在線溶液校準[8]等方法，但仍難于達到溶液樣品進樣ICPMS分析定量校準的線性和標準偏差要求，主要原因在于激光物質相互作用的復雜性，例如分餾效應[9]。

分餾效應是指不同元素在剝蝕蒸發及傳輸過程中行為的差異，測得的樣品組分與樣品組成有一定差異，即元素的非計量剝蝕。它的基體差異性發生在樣品剝蝕、傳輸、蒸發、原子化和電離過程中。對分餾效應的研究多集中在硅酸鹽樣品或是金屬基質樣品[10，11]，研究了分餾效應與激光波長、激光脈沖寬度、激光能量、激光束斑及在ICP中的傳輸和離子化的影響[12，13]。但對于生物樣品的分餾效應研究卻較少。目前，LAICPMS方法在生物醫藥領域的廣泛應用，使得對生物樣品分餾效應的研究顯得尤為重要。

本研究以動物組織為研究對象，研究了213 nm納秒激光剝蝕系統對生物基體樣品的剝蝕顆粒，考察了常見元素和微量元素的分餾效應，探討了元素分餾機理，并對分餾效應的影響因素進行了研究。

2 實驗部分

2.1 儀器及參數

采用LSX213型號213 nm激光剝蝕系統（美國Cetac公司）與Thermo X Series Ⅱ電感耦合等離子體質譜儀 （美國 ThermoFisher Scientific公司） 聯用的 LAICPMS 系統。ICPMS的主要工作參數選擇見表 1。

2.2 試劑

2.3 實驗樣品

實驗所用生物基體樣品均為實驗室自行配制的標準樣品。取豬腎（購于本地超市）切成0.5 cm×0.5 cm薄片，在真空干燥箱中烘干， 待用。配制100和1000 μg/L標準溶液，用移液槍取6.8 μL滴至豬腎切片上，室溫下自然風干。對自行配制的標準樣品進行線掃描剝蝕，其標準曲線相關系數達到0.99～0.999， 信號RSD<6.5%，認為配制的標準樣品具備元素分布均勻性和數據準確性，可用于分餾效應研究。

實驗玻璃基體樣品為美國標準技術研究院（NIST）合成玻璃標準物質 NIST 610。

2.4 激光剝蝕顆粒的收集及表征

在最佳激光剝蝕條件下剝蝕生物基體樣品和玻璃基體樣品（NIST610），產生的剝蝕氣溶膠通過載氣輸出，在輸出口放置干凈硅片并固定，收集30 min剝蝕顆粒后，將硅片密封，待測。利用場發射掃描電子顯微鏡（JSM6700F，日本電子株式會社）表征激光剝蝕顆粒形貌。

3 結果與討論

3.1 激光參數優化

為獲得最優信號強度及穩定性，以Cr為例，對激光剝蝕能量、束斑直徑、掃描速率、頻率和載氣進行了優化，結果如圖1所示。結果表明，當剝蝕能量為25%，束斑直徑為200 μm，剝蝕速率為20 μm/s，頻率為20 Hz，載氣為He + Ar=700 mL+700 mL時，信號強度及RSD最佳。

3.2 分餾效應機理探討

本研究所使用的是納秒激光剝蝕系統， 相對于飛秒激光剝蝕系統分餾效應更強。這主要是由于納秒激光的脈沖持續時間較長，通過雪崩電離獲得激光能量的電子在脈沖結束前會將能量傳遞給晶格，因此在一定聚焦體積內，通過熱聚焦使樣品局部被加熱，導致化學鍵斷裂和部分熔融。樣品內產生的熱梯度導致從聚焦區至周圍的熱傳遞擴散，使得樣品的剝蝕和熔融區遠大于初始聚焦區。正是這種熱效應導致樣品產生大小不一的顆粒。Kuhn等[15]對玻璃標樣的分餾效應進行研究，收集了不同粒徑范圍的剝蝕顆粒，測定了其中的成分，發現剝蝕顆粒大小對分餾效應有直接影響，粒徑小于125 nm和340 nm的剝蝕顆粒中Cu， Zn， Ag， Tl， Pb 和 Bi等易揮發元素相較于Ca出現明顯富集；但其中不完全蒸發、原子化、離子化的大顆粒是分餾效應的主要原因[15]。由于激光剝蝕條件和基體會產生不同的剝蝕顆粒，造成不同的元素分餾效應，因此我們對生物基體樣品和玻璃基體標樣的剝蝕顆粒進行表征，比較了兩種不同基體間的分餾效應。 圖2為生物基體和玻璃基體標樣的剝蝕顆粒SEM表征圖。從圖2可見，生物基體的剝蝕顆粒約為3 μm，且多為較規則的球形；玻璃基體的剝蝕顆粒小于0.5 μm，其形狀多不規則；生物基體的剝蝕顆粒較玻璃標樣的大，這可能是由于基質不同導致；生物樣品剝蝕的激光能量閾值較低[16]，在相同剝蝕條件下，生物樣品所受到的激光能量密度超出其閾值，導致能量快速轉移進入材料，在其融化的樣品表面產生微米級顆粒，同時較大的顆粒也會發生團聚[9，17]。

選取生物基體中31P 元素為內標，在上述優化的最佳剝蝕條件下對大部分ICPMS可測元素相對分餾因子進行考察，結果如圖3所示。實驗未選用13C為內標元素，是考慮到國內供應的氦氣和氬氣中13C 的背景通常較高，不宜使用這種方法[18]。結果表明，生物基體中多數元素的分餾因子為1.0 ±0.1。與玻璃基體相比，生物基體中元素分餾因子較小，這可能是由于基體組成元素及元素間的相互作用有關。玻璃基體中，剝蝕產生的顆粒越小，元素分餾效應越大，尤其是易揮發元素（Ag， Cd， In等）受剝蝕顆粒粒徑影響更為明顯[19]。雖然生物基體剝蝕顆粒的粒徑大于玻璃基體，但研究表明粒徑小于5 μm的顆粒進入ICP后能夠原子化[20]；另一方面，根據剝蝕顆粒的SEM表征結果說明生物基體中大剝蝕顆粒較多，而大顆粒的富集效應相對較小，因此生物基體的相對分餾因子相較于玻璃基體更接近1。

3.3 不同激光參數對分餾效應的影響

本研究所用的激光剝蝕能量均為25%，通過在線掃描的模式下，改變束斑直徑分別為50、100和200 μm， 考察激光剝蝕能量密度對生物基體樣品中V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Ag、Cd、Tl、Pb等元素的分餾效應的影響，結果如圖4A所示。在束斑直徑為200 μm，頻率為20、10和5 Hz時考察頻率對分餾效應的影響。如圖4B所示，激光頻率對分餾效應影響較大。隨著頻率增大，相同時間內剝蝕下來的樣品越多，相對分餾因子更接近1.0；當頻率降至10 Hz時，相對分餾因子超出了1.0 ±0.1的范圍。圖4C為激光剝蝕速率分別30，20，10 μm/s對分餾效應的影響，發現隨著剝蝕速率的減小，相對分餾因子更接近1。

即束斑直徑為200 μm，頻率為20 Hz，剝蝕速率為10 μm/s時，相對分餾因子多在1.0附近。難熔元素如V，Co，Fe等的相對分餾因子與易揮發元素（如Tl、Cd、Zn等）的波動較小。隨著剝蝕量的增加，元素在剝蝕氣溶膠中的富集效應更小，更能體現標樣的均勻性，使得相對分餾因子更接近1.0。

進一步對分餾效應的影響因素進行研究，在上述最佳激光剝蝕條件下，考察了分餾效應與電離能、氧化物沸點和鍵能的關系。從圖5可見，元素相對分餾因子和元素氧化物沸點呈負相關，與電離能和氧化物鍵能呈正相關[20]，表明氧化物沸點低的元素容易原子化，其相對分餾因子增大；電離能和氧化物鍵能低的元素非金屬性越強，相應的氧化物熔點越高，同理，在ICP中原子化能力越差，因此其相對分餾因子越小。

4 結 論

本研究以動物組織為研究對象，研究了213 nm納秒激光剝蝕系統對生物基體樣品和玻璃基體標準樣品的剝蝕顆粒。形貌表征結果表明，生物基體的剝蝕顆粒相較于NIST 610 玻璃標樣更大，達到3 μm。以31P為內標元素，利用相對分餾因子考察了各元素的分餾效應，發現生物基體中元素分餾效應相較于玻璃基體小，大多數元素的相對分餾因子達到1.0 ± 0.1。探討了生物基體中元素分餾機理，分析了生物基體相比于玻璃基體剝蝕顆粒大，而相對分餾因子未明顯增大的原因。一方面可能是粒徑3 μm的顆粒進入ICP后仍能原子化；另一方面，大剝蝕顆粒的富集效應相對較小。進一步對分餾效應的影響因素進行研究發現，分餾效應與剝蝕量有直接關系，并且分餾效應與氧化物沸點呈負相關，而與電離能和氧化物鍵能呈正相關。由于分餾效應不能完全避免，因此在研究時應根據需求對分餾效應、信號強度及穩定性有所取舍。本研究為生物樣品LAICPMS法準確定量分析的可行性提供了重要信息。

References

1 GarbeSchnberg D， Müller S. J. Anal. At. Spectrom.， 2014， 29（6）： 990-1000

2 WANG Ying， GUO YanLi， YUAN HongLin， WEI YongFeng， YAN HongTao， CHEN HuiHui. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228

王 穎， 郭艷麗， 袁洪林， 魏永鋒， 閆宏濤， 陳慧慧. 光譜學與光譜分析， 2012， 32（1）： 223-228

3 ZHANG XinYing， ZHENG LingNa， WANG HaiLong， SHI JunWen， FENG WeiYue， LI Liang， WANG Meng. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， （11）： 1646-1651

張欣穎， 鄭令娜， 王海龍， 史俊穩， 豐偉悅， 李 亮， 王 萌. 分析化學， 2016， （11）： 1646-1651

4 Pozebon D， Scheffler G L， Dressler V L， Nunes M A G. J. Anal. At. Spectrom.， 2014， 29（12）： 2204-2228

5 Lum T S， Tsoi Y K， YueP YK， LeungK S Y. Microchem. J.， 2016， 127： 94-101

6 MorenoGordaliza E， Giesen C， Lazaro A， EstebanFernandez D， Humanes B， Canas B， Panne U， Tejedor A， Jakubowski N， GomezGomez M M. Anal. Chem.， 2011， 83（20）： 7933-7940

7 Austin C， Fryer F， Lear J， Bishop D， Hare D， Rawling T， Kirkup L， McDonagh A， Doble P. J. Anal. At. Spectrom.， 2011， 26（7）： 1494-1501

8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S. J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744

9 Niehaus R， Sperling M， Karst U. J. Anal. At. Spectrom.， 2015， 30（10）： 2056-2065

10 Loewen M W， KentA J R. J. Anal. At. Spectrom.， 2012， 27（9）： 1502-1508

11 Zhang S， He M， Yin Z， Zhu E， Hang W， Huang B. J. Anal. At. Spectrom.， 2016， 31（2）： 358-382

12 Horn I， Günther D. Appl. Surf. Sci.， 2003， 207（14）： 144-157

13 Horn I， Guillong M， Gunther D. Appl. Surf. Sci.， 2001， 182（12）： 91-102

14 Gunther D， Jackson S E， Longerich H P. Spectrochim. Acta B， 1999， 54（34）： 381-409

15 Kuhn H R， Günther D. J. Anal. At. Spectrom.， 2004， 19（9）： 1158-1164

16 Benesova I， Dlabkova K， Zelenak F， Vaculovic T， Kanicky V， Preisler J. Anal. Chem.， 2016， 88（5）： 2576-2582

17 Paltauf G， SchmidtKloiber H. Laser.Surg. Med.， 1995， 16（3）： 277-287

18 WANG Qi， ZHANG Wen， WANG LiYun， LIU YongSheng， HU ShengHong， HU ZhaoChu. Spectrosc. and Spect. Anal.， 2011， 31（12）： 3379-3383

汪 奇， 張 文， 王立云， 劉勇勝， 胡圣虹， 胡兆初. 光譜學與光譜分析， 2011， 31（12）： 3379-3383

19 Ebdon L， Foulkes M， Sutton K. J. Anal. At. Spectrom.， 1997， 12（2）： 213-229

20 WU ShiTou， WANG YaPing， XU ChunXue， YUAN JiHai. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（7）： 1035-1041

吳石頭， 王亞平， 許春雪， 袁繼海. 分析化學， 2016， 44（7）： 1035-1041

Abstract The ablated aerosols of biological matrix sample were studied using 213 nm nanosecond laser ablation system. The stable signal intensity and high sensitivity were obtained when the laser energy was 25%， the spot size was 200 μm， the scan rate was 20 μm/s， the frequency was 20 Hz and the carrier gas was 700 mL He + 700 mL Ar. Relative fractionation index of 56 elements were investigated and 31P as the internal standard element was selected under the optimized laser ablation conditions. The results showed that particle size of the biological sample was 3 μm， which was larger compared with NIST 610 sample. Element fractionation in biological sample was smaller than in glass sample， and relative fractionation index of most elements attained 1.0 ± 0.1. Element fractionation mechanism of biological sample was discussed. The possible reason why the relative fractionation index in biological sample with large particle size did not significantly increase compared to the glass sample is that the 3μm particles entered into ICP can be atomized. On the other hand， enrichment effect for large ablation particles was relatively small. Further study of the influence factors of fractionation effect indicated that， the fractionation effect had relations with laser ablation energy， laser frequency and scan rate， negatively relation with the oxide boiling point， and positively relation with oxide bond energy and ionization energy.

Keywords Laser ablationinductively coupled plasmamass spectrometry； Nanosecond laser； Fractionation effect； Biological sample