利用亞臨界丁烷分離茶樹鮮葉中的阿維菌素

張婭婷+秦廣雍+孔令軍+張書勝

摘 要 以茶樹鮮葉為原料，利用亞臨界丁烷流體分離鮮葉表面殘留的阿維菌素。在料溶比為1∶10（m/V）的條件下，利用響應面法（RSM）的BoxBenhnken Design（BBD）設計實驗，考察不同溫度、時間、分離次數等條件對多酚氧化酶活性的影響，同時分析亞臨界丁烷處理對茶樹鮮葉生理特性的影響。結果表明，亞臨界丁烷流體在保持茶葉物理結構和多酚氧化酶活性基本不變的情況下，可有效分離茶葉中的阿維菌素；通過Design Expert軟件分析，得出分離阿維菌素的最優工藝參數為溫度45℃，時間30 min，分離次數1次，料液比為1∶10（m/V），分離效率大于91%，多酚氧化酶相對活性為25.73%。通過掃描電鏡觀察，茶樹鮮葉結構在丁烷處理前后無明顯變化。本研究結果表明，亞臨界丁烷流體可有效分離茶葉中的農藥殘留，為亞臨界流體在去除天然植物農殘的應用中提供了實驗依據和技術支持。

關鍵詞 亞臨界丁烷； 阿維菌素； 分離； 茶葉； 多酚氧化酶

1 引 言

茶葉中含有茶多酚、咖啡堿、氨基酸等多種營養成分和藥效成分，具有降脂降壓、抗衰老等保健功效。近年來，我國茶葉產量一直居世界首位，帶動了全球茶葉產量持續增長[1]。然而由于不科學使用以及濫用農藥，茶葉中農藥殘留問題依然比較普遍，發達國家對茶葉農殘設置了限量標準，引起了茶葉生產國的高度關注[2，3]。

茶葉中農殘的檢測技術有很多文獻報道[4，5]，但農殘分離的研究相對較少。目前，主要采用超臨界流體萃取（SFE）技術[6]、加速溶劑萃取（ASE）技術[7，8]等分離茶葉樣品中農藥殘留。這些方法對樣品都有不同程度的破壞，無法在保持樣品原形的情況下分離農殘，而且所需工作壓力較大（7～50 MPa），處理樣品量少，不適于大規模產業化生產[9，10]。

亞臨界萃取技術已廣泛應用分離在特種油脂、香精香料等領域[11～13]，具有萃取壓力低、溫度低、效率高、無有害溶劑殘留、綠色環保等優點[14]，可用于工業化生產。聯合國糧農組織指出丁烷可廣泛用于食品加工[15]，而美國、日本及歐洲等國沒有對丁烷殘留的限量要求[16]。

阿維菌素（Avermectin）是由鏈霉菌生產的具有高效殺蟲殺螨效果的抗生素[17]，在我國被廣泛用于茶葉等農作物的蟲害防治。目前，使用亞臨界流體技術分離農殘的研究報道還很少[18，19]。本研究用亞臨界流體丁烷分離茶樹鮮葉中殘留的阿維菌素；利用響應面法（Response surface methodology，RSM）的BoxBenhnken Design（BBD）原理，使用DesignExpert. V8.0.6.1軟件進行分析，優化篩選亞臨界流體丁烷分離茶樹鮮葉中阿維菌素的最佳工藝；通過對茶葉品質指標多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）的檢測和分析，探討此技術的可行性。本研究旨在不破壞茶葉外形的前提下， 實現茶葉表面的農藥殘留的高效分離，為天然植物表面農殘的去除提供理論和技術支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CBE5L亞臨界流體裝置（河南亞臨界公司）；API4000四極桿串聯質譜儀（美國ABI公司）；1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；DJ04B中藥粉碎機（中國上海淀久公司）；FA1104分析天平（上海舜宇恒平公司）；VX200振蕩器（美國Labnet公司；3k15高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；JSM6700F掃描電子顯微鏡（日本電子產業株式會社）；DU800核酸蛋白分析儀（美國Beckman公司）。

多酚氧化酶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、偏磷酸、檸檬酸、NaH2PO4（分析純）； L脯氨酸（層析純）、鄰苯二酚（化學純）均購于上海阿拉丁公司。乙腈、甲醇、丙酮、正己烷（色譜純，美國Baker公司）；N丙基乙二胺吸附劑（PSA，美國Supelco公司）；牛血清蛋白（BSA，美國Roche公司）；丁烷（純度≥95%，河南亞臨界公司）。實驗用水為超純水（18 MΩ.cm）。阿維菌素標準品（Avermectin）、氯唑磷標準品（Isazofos）（純度≥95%，德國Dr. Ehrenstorfer公司），用乙腈配制成標準工作液。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備 選擇信陽地區某茶園主栽的福鼎大白茶為原料。噴灑正常濃度兩倍的阿維菌素（0.5%乳油），3天后采摘茶樹枝條頂端的第1～3片葉（由上至下計），低溫保存、運輸。取茶樹鮮葉100 g，在保證茶葉外形的條件下裝入200目過濾袋，置于密閉萃取罐中；定量注入丁烷液體，控制亞臨界萃取裝置的溫度和壓力；樣品處理完畢后，30℃保存，待檢；每個樣品重復處理3次。

2.2.2 BoxBehnken的響應面設計 在單因素預實驗中，設置溫度（15、25、35和45℃）、時間（10、20、30和40 min）、分離次數（1、2、3次）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15， m/V）4個變量因子，以樣品處理前后阿維菌素的減少量為分離量，計算農殘的分離效率。由于茶樹鮮葉要經過發酵、殺青等不同制茶工藝處理[21]，為了避免高溫導致多酚氧化酶失活[22]，設置溫度上限為45℃。

預實驗結果表明，料液比對實驗結果無顯著影響，可能是因為所用的丁烷相對于茶葉表面的農殘是過量的。以BoxBehnken中心組合設計為原理，以溫度、時間、分離次數3個因子為自變量（分別以A，B，C表示），以阿維菌素分離量為響應值（以y表示），設計了3因子3水平共17個實驗點的響應面分析實驗，實驗所用料液比為1∶10，每個實驗點樣品重復處理3次。響應面設計的參數詳見表1。

2.2.3 農殘檢測方法 標準溶液的配制：準確稱取阿維菌素標準品，用乙腈配制成10 μg/mL的標準儲備液。稱取氯唑磷標準物質，用乙腈稀溶解并配制成20 μg/mL內標使用液[22]。