12種劇毒鵝膏菌的肽類毒素成分鑒定及其相對含量差異比較研究

魏佳會+吳劍峰+陳佳+吳弼東+陳作紅+劉暢+謝劍煒

摘 要 采用高效液相色譜高分辨質譜聯用技術對12種劇毒鵝膏菌的肽類毒素成分及其相對含量進行了比較研究。樣品經含0.5%甲酸50%甲醇溶液提取， 采用Agilent 300ExtendC18色譜柱， 含0.05% TFA的20 mmol/L NH4Ac溶液甲醇為流動相， 梯度洗脫分離。12種鵝膏菌的高效液相色譜質譜聯用分析結果表明， 各鵝膏菌所含毒素種類及相對含量差異較大， 呈現顯著的色譜指紋特征信息， 12種鵝膏菌中共檢測出19種化合物， 13種屬于已知鵝膏肽類毒素， 5種為未知鵝膏肽類毒素， 1種為未知小分子化合物組分。本研究為準確識別鵝膏菌的種類、鵝膏肽類毒素的鑒定、預防和鑒別鵝膏毒肽中毒， 提供了科學依據。

關鍵詞 鵝膏菌； 鵝膏肽類毒素； 質譜； 鑒定； 色譜特征指紋圖譜

1 引 言

我國毒蘑菇種類繁多， 已記載有435種[1]。 近年來， 國內頻發因誤食毒蘑菇的中毒事件[2]， 其中90%以上的死亡事件是由鵝膏菌屬（Amanita）的蘑菇引起的， 主要有灰花紋鵝膏（Amanita fuliginea）、致命鵝膏（A. exitialis）、裂皮鵝膏（A. rimosa）等[3～6]。鵝膏菌的致死性毒素是鵝膏肽類毒素， 根據其氨基酸組成和結構可分為鵝膏毒肽（Amatoxins）、鬼筆環肽（Phallotoxins）、毒傘肽（Virotoxins）三類， 均屬于大環多肽。目前已分離鑒定的天然鵝膏菌毒素有22種， 其中鵝膏毒肽有9種， 屬于雙環八肽， α鵝膏毒肽和β鵝膏毒肽是導致死亡的主要毒素[7]， 鵝膏毒肽非競爭性抑制真核細胞RNA聚合酶II， 阻礙蛋白質的合成， 最終導致肝臟細胞的壞死[8，9]； 鬼筆環肽有8種， 屬于雙環七肽， 主要毒素是二羥鬼筆環肽和羧基二羥鬼筆環肽； 毒傘肽有6種， 屬于單環七肽。目前， 有關毒傘肽的文獻報道較少， 研究多集中于鵝膏毒肽和鬼筆環肽， 而鬼筆環肽與毒傘肽可以破壞球狀肌動蛋白與絲狀肌動蛋白之間的解聚裝配平衡， 從而削弱細胞膜的功能[10]。

鵝膏肽類毒素檢測方法包括顯色檢測法[11，12]、放射免疫檢測法[13～16]、酶聯免疫吸附法[17，18]、紫外吸收光譜法[19]、熒光法[20，21]和毛細管區帶電泳法[22]等。近年來， 高效液相色譜（HPLC）[23，24]以及液相色譜質譜聯用（LCMS/MS）技術[5，19，25～29]逐漸成為鵝膏肽類毒素分析的主流技術，具有所需樣品量少、靈敏度高、檢測速度快和操作簡單等優點， 如LCMS/MS可實現生物樣品和食品等復雜基質樣品中鵝膏肽類毒素的痕量分析[30，31]， LCTOFMS能對樣品中化合物進行質譜全信息采集[5，19，29，32]。本研究通過收集國內外12種劇毒鵝膏菌子實體， 通過對其毒素提取方法進行優化， 采用HPLC建立了12種鵝膏菌的特征指紋圖譜， 并引入潑尼松為內標， 比較了各子實體中毒素的相對含量差異； 在此基礎上， 利用超高效液相色譜電噴霧離子化四極桿飛行時間質譜（UPLCESIQTOF/MS）技術對各毒素進行了鑒定。本方法準確、靈敏度高、特異性好， 可為突發毒蘑菇中毒事件的毒菌及毒素確證分析提供可靠的依據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1100HPLC儀， 配二元梯度泵、VWD檢測器、Agilent Chemstation化學工作站（美國Agilent公司）； ACQUITY 超高效液相色譜， G2四極桿飛行時間質譜儀（QTOF/MS）（美國Waters公司）； RVC 233 CD離心濃縮儀（德國CHRIST公司）； THZD臺式恒溫振蕩器（太倉市實驗設備廠）； KC04粉碎機（北京開創同和科技發展有限公司）； KQ 250E超聲儀（昆山市超聲儀器廠）； R200D電子天平（德國Sartorius公司）， 3k30高速冷凍離心機（美國Sigma公司）。

α鵝膏毒肽（αAmanitin）、β鵝膏毒肽（βAmanitin）、二羥鬼筆環肽（Phalloidin）均購于美國Sigma公司， 純度>90%； 潑尼松（98.50%，中國食品藥品檢定研究院）； 乙酸銨（98%）、三氟醋酸（TFA）購于美國Acros Organics公司； 石油醚、甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）； 甲醇（色譜純，德國Merck公司）； 實驗用水為MilLQ純水機（美國Millipore公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。

2.2 鵝膏菌

假淡紅鵝膏（自采， 菌種鑒定見文獻[33]）， 其余11種鵝膏菌均由湖南師范大學陳作紅教授鑒定并提供， 所有蘑菇均為干子實體， 其采集地點及時間如表1所示。

2.3 樣品前處理

將毒蘑菇干子實體研磨成粉末狀， 稱取0.1 g， 加2 mL含0.5%（V/V）甲酸的甲醇水（1∶1， V/V）溶液， 室溫下240 r/min搖振12 h， 14000 r/min離心10 min； 移取上層清液， 沉淀再加入相同體積的相同溶液超聲30 s， 同法離心， 合并兩次上清液， 旋干； 以1 mL水復溶， 用等體積石油醚萃取去脂， 再次旋干， 用500 μL甲醇水（1∶1， V/V， 含內標）復溶， 過濾， 得鵝膏菌提取液。

2.4 鵝膏肽類毒素的液相色譜分離條件

色譜柱： ExtendC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相A為含0.05% TFA的20 mmol/L NH4Ac溶液， 流動相B為甲醇， 采用梯度洗脫（0～40 min， 10%～50%B； 40～45 min， 50%～10% B； 45～60 min， 10% B）， 流速1 mL/min； 柱溫： 40℃； 進樣量： 5 μL； 檢測波長： 295 nm。