NF-κB調節(jié)TNF-α表達減輕大鼠缺血性腦血管病腦組織損傷

史冬趙建玉閆振宇李璽

(南陽市第三人民醫(yī)院神經內科，河南 南陽 473000)

NF-κB調節(jié)TNF-α表達減輕大鼠缺血性腦血管病腦組織損傷

史 冬 趙建玉閆振宇1李 璽

(南陽市第三人民醫(yī)院神經內科，河南 南陽 473000)

目的 研究缺血性腦血管病(ICVD)核因子 (NF)-κB對腫瘤壞死因子(TNF)-α表達的影響及其對大鼠腦組織損傷的作用。方法 將48只Wistar大鼠隨機分成正常組(12只)、模型組(12只)、假手術組(12只)和吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)+模型組，每組12只。采用線栓法制成大鼠局部缺血再灌注模型，用Ludmila Belayev 12分評分法評估大鼠神經功能，氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色法觀察腦梗死體積，免疫組化法檢測腦組織NF-κB表達，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測腦組織TNF-α含量。結果 模型組大鼠Ludmila Belayev 12得分明顯高于正常組與假手術組(P<0.05)，PDTC+模型組得分顯著低于模型組(P<0.01)；模型組大鼠的腦梗死體積顯著多于正常組和假手術組(P<0.01)，與模型組比較，PDTC+模型組大鼠腦梗死體積顯著減少(P<0.05)；模型組大鼠腦組織NF-κB陽性細胞表達率顯著高于正常組和假手術組(P<0.05)，DPTC+模型組NF-κB表達明顯低于模型組 (P<0.05)；模型組大鼠TNF-α的含量顯著高于正常組和假手術組(P<0.01)，PDTC+模型組TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05)。結論 PDTC抑制NF-κB活性可以減少TNF-α含量，降低TNF-α的表達，所以可通過NF-κB調節(jié)TNF-α表達對缺血再灌注腦損傷起到保護作用，可能與其抑制炎癥反應作用有關。

缺血性腦血管病；腦損傷；核因子-κB；腫瘤壞死因子α

腦血管疾病(CVD)是因為各種腦血管病變引起的腦部病變，多發(fā)生于中老年人，特別是伴有高血壓、冠心病、腦卒中病史的人群，以缺血性腦血管病(ICVD)為主，容易致殘、致死，威脅患者的生命〔1〕。大腦發(fā)生缺血時核因子(NF)-κB可被活化，活化的NF-κB可調控如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β等物質表達增加而引起炎癥級聯(lián)反應，導致腦組織損傷。本文旨在探討NF-κB活性對TNF-α表達的影響及其對ICVD腦組織損傷的保護作用。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級Wistar大鼠48只，雄性，體重(250±10)g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(許可證號：0045071)，飼養(yǎng)在安靜清潔實驗動物房內，溫度(24±2)℃，自然光照12 h，6只/籠，自由攝水及進食。

1.2 實驗藥品、試劑和儀器 TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(碧云天生物技術有限公司)、水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)，一抗二抗免疫組化試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC) (美國SIGMA，批號T8877)，WD-2102A自動酶標儀(北京六一儀器廠)，MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，BX5/TF顯微鏡(日本Olympus)，大鼠手術器械包括手術刀、無菌鑷、止血夾、眼科剪、縫合針、縫合線等。

1.3 動物分組及處理 48只大鼠在籠中飼養(yǎng)5 d以適應環(huán)境，隨機分成正常組、模型組、假手術組、吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)+模型組，每組12只。正常組常規(guī)喂養(yǎng)，模型組術前禁食12 h，按改良后線栓法制作大腦中動脈缺血再灌注模型，再參照Ludmila Belayev 12分評分法做行為學評分以剔除不符合條件的動物，假手術組除不插入栓線外，其余操作均與模型組相同，PDTC+模型組在造模前15 min給予腹腔注射PDTC 15 mg/kg，150 mg/ml。

1.4 線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型〔2〕10%水合氯醛30 mg/kg經腹腔麻醉，將大鼠固定于手術臺，頸部正中切口，暴露右側頸總動脈并分離出頸內動脈和頸外動脈，動脈夾阻斷頸總動脈，于頸外動脈殘端剪一開口插入栓線，輕緩推動尼龍線尾端，于頸內動脈和頸外動脈分叉部沿頸內動脈入顱，推入大約18.0 mm至大腦中動脈，遇到阻力即止。取出動脈夾，結扎頸總動脈分叉處并縫合皮膚。90 min后，再次麻醉大鼠，向外輕拉尼龍線，恢復大腦中動脈血供，完成再灌注。

1.5 Ludmila Belayev 12分評分法〔3〕(1)提尾懸空試驗，即姿勢反射測驗：0分表示無明顯神經功能缺失，1分表示梗死對側肢體屈曲，2分表示側推試驗陽性。(2)肢體放置試驗：①視覺亞實驗，即前言刺激實驗：操作者將大鼠握于手中，使其前爪懸空，自桌面上方10厘米處沿斜線緩慢靠近桌面，正常大鼠的反應為前爪抓向桌面，損傷的大鼠則出現(xiàn)肢體反應遲鈍。0分表示大鼠肢體放置反應正常，1分表示反應延遲但<2 s，2分表示反應延遲并>2 s。側方刺激實驗：操作者讓大鼠位于桌子側方，檢測方法及評分標準與前方刺激相同。②觸覺亞實驗，遮住大鼠雙眼，使其前爪懸空，用大鼠前爪背側輕觸桌面，刺激深度僅限皮膚與毛發(fā)，大鼠反應及評分與視覺亞實驗相同，觸覺刺激同樣包括前方和側方刺激。③本體覺亞實驗：該實驗操作及評分與觸覺亞實驗相同，只是本體覺亞實驗給予大鼠前爪較大壓力，刺激深達肌肉和關節(jié)。該亞實驗只有前方刺激，動物前肢放置實驗得分為0～10分。與視覺亞實驗結合后兩部分實驗得分范圍為0～12分，大鼠功能損傷越重得分越高。

1.6 大鼠腦梗死體積檢測〔4〕成功造模24 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下迅速斷頭取腦，摘除小腦、低位腦干及嗅球，大腦組織于冰箱-20℃保存20 min后取出，連續(xù)冠狀切片6片，厚5 mm，以2%TTC磷酸緩沖液37℃，恒溫避光孵育20 min，期間腦片翻動頻率為1次/5 min。TTC染色后，正常大鼠腦組織呈紅色，梗死區(qū)呈白色，將腦片固定于4%多聚甲醛30 min，拍照后用Image-pro plus6.0圖像分析軟件分析，按公式計算腦梗死體積，結果以腦梗死體積百分比表示〔5〕，腦梗死體積百分比=腦梗死體積/患側總體積×100%。

1.7 免疫組化法檢測大鼠腦組織NF-κB表達〔6〕取腦組織固定于4%多聚甲醛60 min，脫水，蠟塊包埋，切片，置于58℃烤箱1 h抗原熱修復，脫蠟、水化，3%雙氧水孵育10 min，洗片3次，試劑A于室溫下孵育10～15 min，倒除工作液，一抗用PBS 1∶80稀釋后滴于切片，濕盒中37℃孵育2～3 h，再置于室溫30 min，PBS浸洗3次，每次3 min，滴加試劑B和試劑C，室溫孵育15 min，PBS浸洗3次，每次3 min，DAB顯色，沖洗，蘇木素復染，沖洗，脫水，風干，樹膠封片，于BX5/TF顯微鏡下觀察并拍照(10×40倍)，每個切片取5個視野，以MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)定量分析，計算陽性細胞率(%)=陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。

1.8 ELISA法測腦組織TNF-α含量 取腦方法同前，參照ELISA試劑盒說明書嚴格操作，加入相應體積裂解液并勻漿，離心30 min后取上清檢測，計算平均OD值。

1.9 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS12.0軟件行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠缺血再灌注后Ludmila Belayev 12評分結果、腦梗死體積百分比 線栓法制作大鼠缺血再灌注模型后，模型組大鼠Ludmila Belayev 12得分〔(6.61±0.53)分〕明顯高于正常組與假手術組(均為0分)(P<0.05)，PDTC+模型組得分〔(2.20±0.61)分〕顯著低于模型組(P<0.01)；模型組大鼠的腦梗死體積〔(69.12±4.18)%〕顯著多于正常組和假手術組(均為0)(P<0.01)，與模型組比較，PDTC+模型組大鼠腦梗死體積〔(27.25±1.43)%〕顯著減少(P<0.05)。

2.2 大鼠腦組織NF-κB表達和TNF-α含量 激活的NF-κB從胞質進入胞核內呈棕黃色，模型組大鼠腦組織NF-κB陽性細胞表達率〔(56.27±1.08)%〕顯著高于正常組〔(6.01±0.51)%〕和假手術組〔(10.13±0.32)%〕(P<0.05)，PDTC+模型組NF-ΚB表達〔(28.86±0.19)%〕明顯低于模型組(P<0.05)。ELISA法顯示：模型組大鼠TNF-α的含量(58.61±1.59)顯著高于正常組(31.06±1.42)和假手術組(24.95±1.34)(P<0.01)，PDTC+模型組TNF-α含量(35.20±1.63)明顯低于模型組(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫組化法檢測大鼠腦組織NF-κB表達(×400)

3 討 論

ICVD指腦動脈狹窄或閉塞引起相應部位腦組織缺血缺氧甚至壞死，腦缺血將誘發(fā)膜脂質降解、氧化應激、離子超載、炎癥反應、DNA損傷等病理生理改變并發(fā)生神經細胞凋亡〔7〕，造成神經損傷〔8〕。本研究選用對生理指標影響不大的線栓法建立缺血性腦血管病大鼠模型，結果顯示大腦中動脈閉塞導致大鼠腦組織缺血、功能受損，表現(xiàn)出預期的行為學癥狀和病理學改變，提示模型建立成功。

現(xiàn)有資料表明，腦細胞代謝障礙、炎癥反應、自由基損傷等是ICVD的重要損傷機制〔9〕，炎癥細胞和炎癥因子在腦缺血損傷過程中地位和作用越來越受到重視。NF-κB對神經細胞具有一定的保護作用，可能通過以下方式〔10〕：①促進神經元凋亡抑制蛋白(IAP)表達，穩(wěn)定細胞內鈣穩(wěn)態(tài)，促進鈣結合蛋白轉錄，保護神經元；②抑制谷氨酸受體亞單位表達；③誘導超氧化物歧化酶轉錄；④參與TNF-α抗凋亡作用，TNF-α通過NF-κB活化從而調控Bcl-2和Bcl-x的表達實現(xiàn)抗凋亡。但細胞受到氧化應激、細胞因子、內毒素等刺激時，會誘導NF-κB活化，進入細胞核內可激活多種促炎基因的轉錄，上調TNF-α、白細胞介素(IL)-8、黏附分子(ICAM)-1等多種炎癥因子的表達，作為腦缺血后炎癥級聯(lián)反應的啟動因素調控著炎癥反應的發(fā)生與進展〔11，12〕；同時這些炎癥因子又會激活NF-κB，后者將使TNF-α、IL-1β等大量表達，啟動炎癥級聯(lián)反應，甚至誘導細胞凋亡或死亡，形成惡性循環(huán)〔13〕。可能因為大腦缺血導致大量炎癥因子、活性氧流入，激活NF-κB，誘導TNF-α表達等從而參與大腦缺血損傷，又因為TNF-α的增多而導致NF-κB表達進一步增加，放大炎癥反應，如此循環(huán)加重腦組織損傷。黃小平等〔14〕證實黃芪和三七可以抑制小鼠缺血再灌注模型腦組織NF-κB信號通路的激活，減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達，減輕腦組織的繼發(fā)性炎癥反應，從而保護腦組織；鄧冰湘等〔15〕亦報道一些藥物可通過抑制NF-κB，下調TNF-α等轉錄水平，從而抑制炎癥反應，最終發(fā)揮抗炎和保護腦細胞作用；朱曉瓞等〔16〕認為還可以通過NF-κB通路來調節(jié)神經細胞凋亡。抗氧化劑PDTC是NF-κB的活化抑制劑，通過抑制NF-κB的活性有效抑制腦組織TNF-α的表達，其阻斷炎癥惡性循環(huán)，干預腦缺血的病理過程，從而減輕腦缺血再灌注損傷〔17〕，實現(xiàn)保護腦組織。

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〔2016-08-31修回〕

(編輯 郭 菁)

史 冬(1971-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事神經內科腦血管病方面的研究。

R743

A

1005-9202(2017)10-2403-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.023

1 南陽市中心醫(yī)院病理科