外源ALA對葡萄果實品質及PAL活性的影響

張夢燕，孫軍利*，趙寶龍，劉晶晶，張帥，李格

（1. 石河子大學農學院，新疆石河子 832000；2. 特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832000）

外源ALA對葡萄果實品質及PAL活性的影響

張夢燕1,2，孫軍利1,2*，趙寶龍1,2，劉晶晶1，張帥1，李格1,2

（1. 石河子大學農學院，新疆石河子 832000；2. 特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832000）

以露地栽培的歐亞種葡萄克瑞森無核和紅地球為試驗材料，研究了不同濃度的5-氨基乙酰丙酸（ALA）處理對葡萄果實品質及苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性的影響。結果表明，不同濃度ALA處理能明顯提高葡萄果皮花青素含量及糖酸比幅度，以100 mg/L ALA處理表現最好，且葡萄果實中花青素含量與果肉中可溶性糖含量、可滴定酸含量以及果皮內PAL活性密切相關。果皮中花青素含量與合成相關PAL酶活性、總糖的含量變化趨勢呈顯著正相關，與總酸含量呈顯著負相關，表明ALA處理能有效改善葡萄果實品質及促進葡萄果實著色。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）；葡萄；花青苷；品質；PAL活性

果實色澤是作為鮮食消費的重要依據，也是影響葡萄酒品質的重要因素[1-2]。花色苷作為自然界一種重要的植物水溶性色素，是花青素和糖以糖苷鍵結合而成的一種黃酮類化合物，普遍存在于植物的花、葉、莖、果實和根器官中，通過在細胞的細胞質和內質網膜內合成運輸到液泡中，使果實表面呈現出紅、紫紅到藍等不同顏色。有研究表明，果皮中花色苷能夠提高植物抗光氧化性和抗病性。經常食用花色苷還有利于人體健康，并具有良好的抗氧化、防衰老、抗癌等功效。苯丙氨酸裂解酶（Phenvlalanine Ammonia Lvase，PAL）是一種受多種外界因素影響的誘導酶，通過轉錄合成能夠催化花青苷的生物合成，屬于葡萄花色苷生物合成途徑中初始反應的關鍵酶。通過對PAL活性的調節，有學者研究認為PAL能夠促進牽牛花等植物中花色苷的形成和積累，從而有效改變矮牽牛的花色[3]。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）作為自然界動植物以及微生物體內存在的一種生理活性物質，與生命活動有著密切聯系。有研究指出，ALA處理能夠促進植物葉片光合效率，提高作物產量并改善品質[4]，調節植物的生長發育，被視為一種植物生長調節物質[5]。謝荔[6]對ALA誘導葡萄和蘋果果皮花青素積累機理的研究結果表明，ALA處理能夠顯著提高葡萄果實可溶性糖含量，降低可滴定酸含量，且一定濃度的ALA能顯著提高葡萄果皮花青素含量。新疆具有豐富的光熱資源，屬于葡萄種植的優勢產區。但目前生產中有些葡萄品種存在著色困難問題，其中噴施外源ALA改善果品色澤已經在蘋果、番茄、紅棗等植物上普遍應用，但有關外源ALA是否能夠有效促進葡萄果實著色，提高葡萄果實品質及PAL活性的研究較少。本試驗以露地栽培歐亞葡萄品種克瑞森無核和紅地球為試驗材料，研究不同濃度ALA處理對發育成熟期的葡萄果皮著色效果、果實品質及相關酶活性的影響，為ALA在葡萄生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選取石河子大學農學院試驗站葡萄園的歐亞葡萄品種克瑞森無核和紅地球為試驗材料，采用水平連疊式棚架露地栽培，株行距0.5 m×3.5 m，東西行向，獨龍干整形，葡萄果實性狀表現均勻一致。

1.2 方法

選擇架勢、長勢和負載量均相似的葡萄植株，在葡萄花青素形成的兩個高峰期即盛花期后4～8周和14～18周將待用的葡萄果穗用0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的ALA溶液噴施葡萄植株及果穗，其中0 mg/L是以清水噴施為對照。在克瑞森無核和紅地球兩個品種完全成熟期進行采樣，每個處理采集3穗果，3次重復，測定葡萄果實的各項生理指標。

1.2.1 果實品質測定

可溶性糖含量測定參照李合生[7]的方法：用蒽酮比色法。可滴定酸含量的測定采用酸堿滴定法[8]。在采集的每個處理果穗中隨機選取10粒長勢較一致的果粒，去皮后的新鮮果肉用榨汁機打碎混勻，稱取3份各1g，用以可溶性糖、可滴定酸含量的測定，重復3次。

1.2.2 果皮PAL活性測定

果皮PAL酶活性測定參考Lister等[9]方法并加以改進，每個處理分別稱取果皮1 g，加液氮研磨至粉末狀后加入5 mL提取液（0.05 mol/L Na2HPO4(pH7.0)；0.05 mol/L 抗壞血酸；0.018 mol/L巰基乙醇），冰浴勻漿，4 ℃，15 000 r/min離心20 min，上清液即為酶液。取1 mL酶液，加入3 mL反應體系中（2 mL的0.2 mol/L，pH 8.8 的硼酸緩沖溶液；1 mL的0.05 mol/L L-苯丙氨酸），于37 ℃水浴中反應90 min，后加入0.2 mL 6 mol/L HCl終止反應，離心去除沉淀，測定290 nm下吸光值。每分鐘光密度變化0.01為1個酶活力單位（U）。酶活性單位表示為U/g FW。

1.2.3 果皮花青素含量測定

果皮花青素含量的測定按照仝月澳等[10]方法加以改進，在采集的每個處理果穗中隨機選取10粒均勻一致的果實，剝取果皮用液氮速凍帶回實驗室于-80 ℃超低溫冰箱中貯存待測。每個處理分別稱取葡萄果皮1 g剪碎混勻放入刻度試管中，加0.1 mol/L HCl溶液10 mL（蓋緊杯口）置32 ℃恒溫箱中提取4 h以上，過濾，濾液為花青素提取液，在530 nm波長下測定吸光值。將讀取的光密度值乘以10用以代表花青素相對濃度（U/g FW）。

2 結果與分析

2.1 ALA處理對葡萄果肉中可溶性糖、可滴定酸含量及糖酸比的影響

圖1、圖2顯示的是不同濃度ALA處理后葡萄果實完全成熟時可溶性糖與可滴定酸含量的變化。由這兩個圖可知，在葡萄果實著色期用不同濃度ALA處理可在不同程度上提高果實的可溶性糖含量，同時降低可滴定酸含量。從圖1中可看出，經不同濃度ALA處理后，兩品種果實中可溶性糖含量明顯高于對照處理，以100 mg/L ALA處理表現最好，且顯著高于對照，克瑞森無核高達20.23%，紅地球達到14.93%。同時，圖2顯示所有濃度ALA處理兩葡萄品種果實中可滴定酸含量明顯低于對照，雖差異幅度較糖變化小，但也可看出100 mg/L ALA處理的效果最顯著，克瑞森無核葡萄果肉總酸度為0.16%，紅地球為0.15%。

結合圖1、圖2，從圖3中可看出，由于可溶性糖含量的上升，可滴定酸下降，3種濃度ALA處理在不同程度上提高了果實的糖酸比，其克瑞森無核葡萄平均增幅達41.83%，紅地球葡萄平均增幅達42.54%。

2.2 ALA處理對葡萄果皮中PAL活性變化的影響

圖1 不同濃度ALA處理對克瑞森無核及紅地球葡萄果實可溶性糖含量的影響

圖2 不同濃度ALA處理對克瑞森無核及紅地球葡萄果實可滴定酸含量的影響

圖3 不同濃度ALA處理對克瑞森無核及紅地球葡萄果實糖酸比的影響

從圖4中可看出，經不同濃度ALA處理后，兩品種葡萄果皮中PAL的活性顯著高于對照，同樣以100 mg/L ALA處理的促進效應表現最好，克瑞森無核達到134 U/g FW，紅地球達到126 U/g FW，50 mg/L和150 mg/L ALA處理之間差異幅度較小。

2.3 ALA處理對葡萄果皮中花青素含量變化的影響

由圖5可知，不同濃度ALA處理對葡萄果皮中花青素含量增加的促進效應不同。經不同濃度ALA處理后，兩品種葡萄果實完全成熟時花青素含量大幅度提升，顯著高于對照處理。其中，100 mg/L ALA處理的促進效應最顯著，克瑞森無核葡萄果皮中花青素含量達35.3 U/g FW，紅地球達30.4 U/g FW，50 mg/L和150 mg/L ALA處理之間無顯著差異。

2.4 果皮花青素與其合成相關PAL酶活性、果肉糖、酸含量的相關性分析

應用 SPSS 16.0對100 mg/L ALA處理的克瑞森無核和紅地球兩品種果皮花青素與其合成相關PAL活性、果肉可溶性糖、可滴定酸含量進行線性相關分析，結果表明，克瑞森無核和紅地球葡萄果皮中花青素的形成與果肉中糖積累量具有顯著的正相關關系，同時與果肉中酸含量呈明顯負相關。兩品種果皮中的花青素的積累量與其合成相關PAL活性均達顯著水平。相關系數見表1。

圖4 不同濃度ALA處理對克瑞森無核及紅地球葡萄果皮PAL活性的影響

圖5 不同濃度ALA處理對克瑞森無核及紅地球葡萄果皮花青素含量的影響

表1 克瑞森與紅地球葡萄果皮花青素與糖、酸及PAL活性的相關系數

3 討論與結論

果皮色澤是衡量鮮食葡萄果品商品價值的重要指標，同時也是釀酒葡萄果實重要質量指標。大量研究證明，花色苷的含量以及不同花色苷的組成比例是使葡萄漿果與葡萄酒呈現不同顏色的主要因素。花色苷的合成與可溶性糖、可滴定酸含量密切相關[11-12]。花色苷分子由糖和花色素組成，糖不僅是花色苷合成的關鍵前體物質，更多是通過信號機制作為信號物質促進花色苷的合成。曹雄軍等[13]對歐亞種葡萄紅寶石無核和紅地球果實著色與糖含量關系研究發現，隨著果實不斷發育，葡萄果皮中花色苷含量與果肉中糖積累量的相關性達到極顯著水平，同時與葡萄果肉中酸含量呈極顯著負相關，這一結論與本試驗結果相符。

PAL基因的表達受到各種類型外源植物激素的影響，王中華等[14]通過在蘋果果實著色期噴施ALA對蘋果果皮花青素形成的促進效應研究發現，經ALA處理后，果實中可溶性固形物含量顯著提高，酸度明顯降低，在光照36 h內其果皮中PAL的活性呈現先升高后下降的趨勢，且在離體條件下蘋果果皮花青素的積累量明顯提高。還有學者提出，不僅ALA處理能夠促進“富士”蘋果果皮中花青素的積累，且ALA生物合成前體谷氨酸也能明顯提高花青素的含量[15]。因而，ALA處理對提高果實品質效應具有一定的普遍性。

本研究表明，一定濃度的外源ALA處理能夠顯著提高葡萄果皮花青素含量及合成相關PAL酶活性，且提高果實可溶性糖含量，可滴定酸含量相應降低，糖酸比大幅度提升，改善了葡萄果實的品質，對葡萄果實著色具有很好促進作用。但從ALA的具體濃度分析來看，ALA對葡萄果實的這種促進作用并不隨其濃度的增大而增強，根據ALA濃度的配比存在其處理的最適濃度。本研究發現ALA處理能夠大幅度提升葡萄果實的糖酸比，這與前人在ALA促進蘋果糖酸含量積累的結果相似。但ALA對促進果實花色苷合成生理機制的研究尚不明確，需進一步試驗探討。

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Effects of exogenous ALA on fruit quality and PAL enzyme activity of grapevine

ZHANG Mengyan1,2, SUN Junli1,2*, ZHAO Baolong1,2, LIU Jingjing1, ZHANG Shuai1, LI Ge1,2
(1. College of Agronomy, Shihezi University, 2. Production and Construction Corps Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germlasm Resources Utilization, Shihezi 832000)

Crimson Seedless and Red Globe (Vitis vinifera L.cv.) in the open field cultivation as experimental materials, were treated by different concentrations of ALA to investigate the effect of ALA on grape quality and PAL enzyme activity. Results showed that in the process of fruit ripening, sugar, acid and anthocyanidin synthesis related regulatory gene was closely related with the accumulation of anthocyanidin, ALA treatment could obviously increase the contents of sugar and acids in berries, and anthocyanidin content in pericarp, the 100 mg/L ALA treatment was the best. There were signifi cant positive correlation between anthocyanidin content and PAL activity and total sugar content, which was negatively correlated with total acid content. The results indicated that ALA could effectively improve quality and coloration of berries.

5-aminolevulinic acid(ALA); grape; anthocyanidin; quality; PAL enzyme activity

S663.1；Q945.15

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.03.003

2017-03-05

國家自然科學基金資助項目（31560542）；新疆建設兵團應用基礎研究計劃項目（2016AG007）

張夢燕，女，四川簡陽人，在讀碩士研究生。E-mail: 1511449518@qq.com

*通訊作者：孫軍利，E-mail: 1530322722@qq.com